重组人源Ⅰ型胶原蛋白Ⅰα1x6、表达菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组人源Ⅰ型胶原蛋白Ⅰα1x6、表达菌株及其应用。所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1xN由若干个重组人源Ⅰ型胶原蛋白I 69aa亲水性片段串联而成。本发明专利技术的重组人源Ⅰ型胶原蛋白表达菌株能够有效稳定和大量地表达重组人源Ⅰ型胶原蛋白。本发明专利技术的重组人源胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其69氨基酸长度的重复短肽结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体中不会造成免疫排斥。本发明专利技术的重组人源Ⅰ型胶原蛋白与传统的罗非鱼皮胶原相比，能够显著提高皮肤含水量、改善皱纹尺寸、深度和纹理，可以广泛应用于生物医用材料、化妆品等领域。化妆品等领域。化妆品等领域。

【技术实现步骤摘要】
重组人源Ⅰ型胶原蛋白Ⅰα
1x6、表达菌株及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及一种重组人源Ⅰ型胶原蛋白Ⅰα1x6、表达重组人源Ⅰ型胶原蛋白Ⅰα1x6的毕赤酵母工程菌及其应用。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是一种生物高分子物质，是维持肌肤和组织器官的形态和结构以及修复各损伤组织的重要物质。其主要存在于人和动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织中重要的结构蛋白质。胶原蛋白可以给予含有胶原蛋白的皮肤层所必需的养分，使皮肤中的胶原蛋白活性加强，保持角质层水分以及纤维结构的完整性，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢，增加循环，达到滋润皮肤延缓老化，美容，消皱，养发的目的。
[0003]生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱或酶来处理动物组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼皮/鳞等)，从中提取胶原蛋白。这些方法虽然成本低廉、回收率较高，但是存在以下问题：(1)制取的胶原蛋白均为分子量很小且长度不等的混合胶原蛋白肽段，俗称明胶，很难起到保湿、滋养的效果；(2)提取工艺简单粗放，产物纯度不佳，常有异味；(3)来源于动物，无法摆脱生物安全隐患，极大的限制了传统胶原在化妆品、食品、药品等各类产品中的广泛应用；(4)加工提取时产生巨量废水严重伤害环境；(5)技术门槛低，原料来源不易控制，造成皮鞋奶、毒胶囊横行，食品、药品安全隐患严重。
[0004]为了解决传统动物胶原的一系列问题，许多学者开始着手应用生物技术来生产重组胶原。因微生物培养的种种便利，利用重组微生物生产胶原逐渐成为主流。范代娣等人应用大肠杆菌高密度发酵培养生产的重组类人胶原蛋白，并已成功应用到化妆品领域，实现了产业化生产(中国专利201310157411.7，201510883010.9等)。。但是细菌表达体系具有内毒素、热原等生物安全问题，使得产品的生产、检测成本高企，并存在隐患；表达的蛋白以包涵体形式存在细菌细胞内，产物纯化困难、回收率受限制；另外原核表达系统比较低级，不能完成表达产物的翻译后加工修饰，使产物不具有生物活性。
[0005]因此，越来越多的学者开始利用真核微生物生产重组胶原蛋白。酵母菌具有天然的优势。首先酵母已经在食品、医药化工等行业有着悠久的使用历史，同时可以用于外源蛋白的分泌表达，有利于下游的分离纯化工艺，同时不会像细菌那样存在内毒素及热源等的生物安全性问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种亲水性优异的重组人源Ⅰ型胶原蛋白，以及分泌表达该蛋白的毕赤酵母工程菌及其应用，能高效、安全地进行重组人源Ⅰ型胶原蛋白的胞外分泌表达。
[0007]实现本专利技术目的的技术方案如下：
[0008]本专利技术的重组人源Ⅰ型胶原蛋白I 69aa，氨基酸序列如SEQ No.2所示。
[0009]本专利技术的重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1xN，由N段SEQ No.2所示的重组人源Ⅰ型胶原蛋白I 69aa串联而成，N≥2。
[0010]在具体的实施方式中，本专利技术提供了一种重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1x6即I 414aa，由6段SEQ No.2所示的重组人源Ⅰ型胶原蛋白I 69aa串联而成，氨基酸序列如SEQ No.3所示。其理论分子量约38.345kd。
[0011]本专利技术的重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1x6的编码基因，核苷酸序列如SEQ No.4所示。
[0012]本专利技术构建的重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1x6的核苷酸序列如SEQ No.5所示，通过将重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1x6的编码基因双酶切连接至ppic9K载体的EcoR I和Not I间构建而成。
[0013]本专利技术构建的分泌表达重组人源Ⅰ型胶原蛋白的菌株为巴斯德毕赤酵母Pichia pastorisJY0401，保藏编号为CGMCC No.16463，该菌种已于2018年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0401通过将Sac I酶切得到的线性化重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1x6诱导入巴斯德毕赤酵母中构建而成。
[0014]本专利技术还提供上述重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1x6在制备去皱护肤品中的应用。
[0015]优选地，上述去皱护肤品中，重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1x6的浓度为0.1～0.75％(w/v，g/mL)，更优选为0.5～0.75％(w/v，g/mL)。
[0016]本专利技术从已知序列的人体胶原蛋白基因I型的螺旋区中选择水溶性、稳定性强的核苷酸序列，将优选基因片段插入毕赤酵母表达质粒中，转化毕赤酵母筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌，经过初步发酵及纯化步骤，得到高纯度的重组类人胶原蛋白。本专利技术的重组人源Ⅰ型胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥。本专利技术的重组人源Ⅰ型胶原蛋白与传统的罗非鱼皮胶原相比，能够显著提高皮肤含水量、改善皱纹尺寸、深度和纹理，在生物医用材料、化妆品等领域具有潜在的应用前景。
附图说明
[0017]图1为人Ⅰ型α1链胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。
[0018]图2为重组人源Ⅰ型胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。
[0019]图3为重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1x6的构建示意图。
[0020]图4为重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1x6的Sc I酶切琼脂糖凝胶电泳图。
[0021]图5为电转后的毕赤酵母GS115平板图。
[0022]图6为阳性克隆菌株的凝胶电泳图。
[0023]图7为阳性克隆菌株的PCR凝胶电泳图。
[0024]图8为#8阳性克隆菌株培养0、24、48、72和96小时样品的蛋白表达分析图。
[0025]图9为#9阳性克隆菌株培养0、24、48、72和96小时样品的蛋白表达分析图。
[0026]图10为#10阳性克隆菌株培养0、24、48、72和96小时样品的蛋白表达分析图。
[0027]图11为#10阳性克隆菌株培养0、24、48、72和96小时样品的蛋白表达分析图。
[0028]图12为水分改善率结果图。
[0029]图13为皱纹改善率结果图。
[0030]图14为纹理改善率结果图。
具体实施方式
[0031]下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步详述。实施本专利技术的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。
[0032]实施例1
[0033]1.蛋白序列选择
[0034]对人Ⅰ型α1链胶原蛋白的氨基酸序列(SEQ No.1)进行疏水性分析，评价结果如图1所示。疏水性评价分值越低其亲水性越好。根据疏水性分析结果，选择评分低的氨基酸片段，取其中69个短肽单位片段(即重组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组人源Ⅰ型胶原蛋白I 69aa，氨基酸序列如SEQ No.2所示。2.重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1xN，由N段SEQ No.2所示的重组人源Ⅰ型胶原蛋白I 69aa串联而成，N≥2。3.根据权利要求2所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1xN，其特征在于，为重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1x6，由6段SEQ No.2所示的重组人源Ⅰ型胶原蛋白I 69aa串联而成，氨基酸序列如SEQ No.3所示。4.根据权利要求3所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白Iα1x6的编码基因，核苷酸序列如SEQ No.4所示。5.重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1x6，核苷酸序列如SEQ No.5所示。6.根据权利要求5所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵健烽，朱逸丽，余继刚，高力虎，冯丽萍，黄建民，
申请(专利权)人：江苏江山聚源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：