用于HLA-DR*13基因检测的引物组、探针、试剂盒及其方法技术

本申请公开了一种用于HLA

【技术实现步骤摘要】
用于HLA
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DR*13基因检测的引物组、探针、试剂盒及其方法


[0001]本申请涉生物医药工程的
，尤其是涉及一种用于HLA
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DR*13基因检测的引物组、探针、试剂盒及其方法。

技术介绍

[0002]人类白细胞抗原(HLA)是人类的主要组织相容性复合体(MHC)的表达产物，分布于白细胞表面和全身组织细胞，其决定了机体的组织相容性，是由人体6号染色体上的一组基因调控表达的。HLA的化学本质为一类糖蛋白，由一条被糖基化的α重链和一条β轻链非共价结合而成，其肽链的氨基端向外，羧基端穿入细胞质中，中间疏水部分位于胞膜中。
[0003]HLA作为人体组织细胞的遗传标志，特别是位于免疫细胞上的HLA具有向抗原特异性T细胞受体(TCR)传递抗原多态性的生物学特性，在抗原识别、免疫应答以及免疫调控等方面起到重要作用。HLA是人体内首次发现的与疾病有明确关系的遗传系统，是目前已知最复杂的人类基因复合体，根据功能可将其分为Ⅰ、Ⅱ以及Ⅲ类基因。
[0004]其中，Ⅱ类抗原是CD4分子的配体，参与T细胞应答、免疫应答的遗传控制、约束免疫细胞间的相互作用、抗原呈递、免疫调节以及免疫细胞分化等过程。在已知HLA的Ⅱ类抗原中HLA
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DRB多态性最为复杂，该类抗原的基因编码区中已经发现了227个以上的等位基因，人体免疫应答基因位于该类抗原的基因编码区内，人体免疫应答强弱受到HLA
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DR基因的控制。最近的研究中发现，HLA
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DR基因与慢性重型乙肝肝炎发病进程有密切的关系。
[0005]慢性乙肝肝炎是指乙肝病毒(HBV)检测呈阳性，病程超过半年或发病日期不明确而临床有慢性肝炎表现者，其临床表现为乏力、畏食、恶心以及肝区疼痛等症状；其中，慢性重症乙肝肝炎是乙型肝炎常见的致命原因。
[0006]人体受到HBV感染后，免疫系统被激活发生免疫应答反应，但是由于机体内免疫应答反应过强，导致免疫系统攻击自身的肝细胞，导致肝细胞大量坏死和凋亡，导致肝功能衰竭；并且在这过程中，机体的内环境发生改变，使得肠粘膜屏障功能下降，肝脏Kupffer细胞吞噬功能下降，导致体内内毒素增多，激活Kupffer细胞释放出细胞因子以及炎症递质等物质，进而引发肝循环障碍，对肝脏造成二次打击，使得肝损伤持续存在，并且不断加重，最终导致慢性重症乙肝肝炎的发生。
[0007]研究认为，人体感染HBV之后病程的发展主要取决于个体的免疫应答状况，而病毒特异性的T细胞反应对HBV病毒的清除起着关键作用，尤其是HLA
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DR限制性的特异性CD4+T细胞，其诱导HBV病毒特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应的发生，且辅助B淋巴细胞产生针对HVB外膜和核衣壳的抗原。其中，HLA
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DR13能比其他HLA
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DR呈递更多的HBV抗原决定簇，因而能诱导机体发生更强烈的HVB病毒特异性的CD4+T细胞反应，使得机体免疫应答过强导致肝组织细胞的大量坏死和凋亡，导致慢性重症乙肝肝炎的发生。HLA
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DR13基因与乙型慢性肝炎基础上法还是能的重症肝炎有密切关系，是一个对判断病情以及预测病程发展有价值的指标。
[0008]目前，HLA
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DR*13基因检测方法主要有Sanger测序法，其利用ddNTP的3
’
端不含有
羟基无法形成磷酸二酯键导致DNA合成中断的原理。在Sanger测序法的过程中，利用一种DNA聚合酶来延伸结合在特定序列模板上的引物，当合成进行到一定程度上后，往反应体系中加入一种荧光标记的ddNTP，产生以不同核苷酸结束的多组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测。使用Sanger测序法进行HLA
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DR*13基因检测具有较高的准确性，但是，Sanger测序法的操作较为繁琐，所需要的时间较长，不适合高通量的检测。

技术实现思路

[0009]为了缩短HLA
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DR*13基因检测的时间，提高检测效率，对HLA
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DR*13基因进行高通量检测，本申请提供一种用于HLA
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DR*13基因检测的引物组、探针、试剂盒及其方法。
[0010]第一方面，本申请提供一种用于HLA
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DR*13基因检测的引物组及其相应探针，采用如下的技术方案：一种用于HLA
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DR*13基因检测的引物组及其相应探针，包括根据HLA
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DR*13等位基因特异位性设计的引物组和探针，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和如SEQ ID NO：1所示的反向引物；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；或其互补序列。
[0011]通过采用上述技术方案，引物组和探针是根据HLA
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DR*13等位基因特异位性设计的，正向引物和反向引物能分别与含有HLA
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DR*13等位基因的DNA链的两条单链紧密地碱基互补配对，实现对HLA
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DR*13基因序列的有效特异性扩增，并且探针能识别HLA
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DR*13基因上的特异性位点且与其碱基互补配对，通过引物组、探针与HLA
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DR*13基因的两次碱基互补配对实现对HLA
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DR*13基因的特异性检测。
[0012]第二方面，本申请提供了一种试剂盒，采用如下的技术方案：一种试剂盒，包括上述所述的用于检测HLA
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DR*13基因的引物组和探针。
[0013]优选的，还包括内标引物和内标探针。
[0014]优选的，所述内标引物组和内标探针是根据HLA
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基因上的保守序列设计的。
[0015]优选的，所述内标引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向内标引物和如SEQ ID NO：1所示的反向内标引物；所述内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0016]通过采用上述技术方案，保守序列指的是具有高度相似性或同一性的分子序列，存在于所有的HLA基因上；在HLA
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DR*13基因检测的过程中，使用该保守序列特异性设计的内标引物和内标探针作为参照物，可以校正上样过程中存在的操作误差，保证检测体系的有效性，进而实现提高HLA
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DR*13基因检测的准确性。
[0017]优选的，所述探针和内标探针为荧光探针。
[0018]优选的，所述探针和内标探针上标记有荧光基团，所述荧光基团独立地选自FAM、TET、JOE、HEX、CY3、TAMRA、ROX、Texas Red、VIC、HEX或ROX。
[0019]优选的，所示探针和内标探针上标记有淬灭基团，所述淬灭基团独立地选自BHQ
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0、BHQ
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于HLA
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DR*13基因检测的引物组及其相应探针，其特征在于，包括根据HLA
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DR*13等位基因特异性设计的引物组和探针，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和如SEQ ID NO：2所示的反向引物；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；或其互补序列。2.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的用于检测HLA
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DR*13基因的引物组和探针。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括内标引物和内标探针。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述内标引物组和内标探针是根据HLA
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D区基因上的保守序列设计的。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述内标引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的正向内标引物和如SEQ ID NO：5所示的反向内标引物；所述内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：林祥华，林泽曦，
申请(专利权)人：厦门倍博特医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：