一种高纯度蜂毒肽及其制备方法技术

本发明专利技术涉及医药技术领域，具体公开一种高纯度蜂毒肽及其制备方法。本发明专利技术提供的高纯度蜂毒肽的制备方法，通过将蜂毒粗品溶于纯化水后离心去除水不溶杂质，然后调节离心液的pH为3.0～4.0，可使蜂毒粗品中的部分杂质在此pH条件下沉淀除去，同时此pH条件还可使病毒灭活，再将pH调节为4.5～5.5，有利于提高蜂毒的稳定性；再经超滤浓缩的方法除去离子以及组胺等小分子杂质后，以填料为聚苯乙烯微球的DAC

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度蜂毒肽及其制备方法


[0001]本专利技术涉及蜂毒肽制备
，尤其涉及一种高纯度蜂毒肽及其制备方法。

技术介绍

[0002]蜂毒肽(Melittin，MLT)是蜂毒中的主要活性成分，由26个氨基酸残基组成，约占蜂毒干重的50％左右。蜂毒肽作为典型的抗菌肽，具有镇痛、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等药理活性，具有较高的科学研究价值和广泛的医疗应用价值。
[0003]蜂毒是一种复杂的混合物，其中含有的大分子量的酶类物质容易造成过敏，小分子量的胺类物质容易造成疼痛，因此，去除这些物质，提高蜂毒肽的纯度，对于蜂毒在临床上的推广应用具有重要意义。但是，目前蜂毒肽纯化过程中涉及的工艺步骤繁琐，操作复杂，纯化过程中蜂毒肽损失严重，使得蜂毒肽的制备成本较高，阻碍了蜂毒肽的进一步开发和应用。
[0004]目前，高纯度蜂毒肽的制备方法有：将蜂毒肽溶于水后，离心分离，向离心液中加入乙醇去除沉淀、正丁醇萃取、乙醇二次去除沉淀，得到的粗蜂毒水溶液经多次葡聚糖凝胶柱色谱纯化、超滤、冷冻干燥，得到蜂毒肽，蜂毒肽的含量在45.34％
‑
87.83％，蜂毒肽的含量较低，且制备方法繁琐，生产成本较高。因此，研发一种操作简单、蜂毒肽的收率和纯度均较高的高纯度蜂毒肽的制备方法，对于扩大蜂毒肽在医药领域的进一步开发和应用具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0005]针对现有制备蜂毒肽的方法存在的操作繁琐、成本高，以及制备得到的蜂毒肽的收率和纯度较低的问题，本专利技术提供一种高纯度蜂毒肽及其制备方法，其主要通过将蜂毒水溶液离心后在特定pH除杂、超滤，以及制备色谱进行分离纯化，有效提高了蜂毒肽的纯度。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案是：
[0007]一种高纯度蜂毒肽的制备方法，包括如下步骤：
[0008]步骤a，将蜂毒粗品加入纯化水中，分散均匀，离心，得蜂毒离心液；
[0009]步骤b，调节所述蜂毒离心液的pH为3.0～4.0，静置1h～2h，过滤，得第一滤液；然后调节所述第一滤液的pH为4.5～5.5，过滤，得第二滤液；
[0010]步骤c，将所述第二滤液用截留分子量500Da～1000Da的超滤膜进行超滤浓缩，收集滤余液，得蜂毒超滤液；
[0011]步骤d，将所述蜂毒超滤液经反相高效液相制备色谱进行分离纯化，收集目标组分，合并蜂毒肽HPLC纯度大于99％的洗脱液；其中，所述制备色谱柱为DAC
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100，填料为聚苯乙烯微球，流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为含三氟乙酸的甲醇溶液或含三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脱；
[0012]步骤e，将所述蜂毒肽洗脱液用截留分子量500Da～1000Da的超滤膜进行超滤浓
缩，收集滤余液，冻干，得蜂毒肽产品。
[0013]相对于现有技术，本专利技术提供的高纯度蜂毒肽的制备方法，通过将蜂毒粗品溶于纯化水后离心去除水不溶杂质，然后调节离心液的pH为3.0～4.0，可使蜂毒粗品中的部分杂质在此pH条件下沉淀除去，同时此pH条件还可使病毒灭活，再将pH调节为4.5～5.5，有利于提高蜂毒的稳定性；再经超滤浓缩的方法除去离子以及组胺等小分子杂质后，以填料为聚苯乙烯微球的DAC
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100色谱柱进行制备色谱纯化分离，最终得到含量可达99％以上的高纯度蜂毒肽。
[0014]本专利技术仅通过离心、调节pH以及超滤、制备色谱分离等简单工艺就可将蜂毒粗品中的致敏物质和无效杂质分离除去，有利于实现快速、大量生产精制蜂毒产品的目的，产品纯度可达到99％以上，提高了临床用药的安全性，且无需经过葡聚糖凝胶柱多次纯化，有效简化了蜂毒肽的制备工艺，降低了成本低，具有极高的推广应用价值。
[0015]本专利技术中所述制备色谱柱优选江苏汉邦科技有限公司生产的型号为DAC
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100(100mm*250mm)制备柱；其填料优选为聚苯乙烯微球Uni PS 20
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300。
[0016]优选的，步骤a中，所述蜂毒粗品与纯化水的质量比为1：8～10。
[0017]优选的蜂毒粗品于纯化水的比例，可使蜂毒充分溶解，并尽可能多地除去水不溶性杂质，提高蜂毒肽的纯度。
[0018]优选的，步骤a中，离心的转速为4000r/min～6000r/min，离心时间为15min～30min。
[0019]优选的离心转速和离心时间，可尽量多地除去水不溶性杂质。
[0020]可选的，步骤b中，选择1.0mol/L盐酸溶液调节所述蜂毒离心液的pH为3.0～4.0。
[0021]优选的酸性条件，可以使病毒灭活，同时可尽可能多地使蜂毒粗品中的杂质沉淀析出。
[0022]可选的，步骤b中，选择1.0mol/L氢氧化钠溶液调节pH为4.5～5.5。
[0023]优选的pH值有利于提高蜂毒肽在纯化过程的稳定性保证精制蜂毒肽产品的质量稳定。
[0024]可选的，步骤b中，第一滤液调节pH为4.5～5.5后，采用0.45μm的滤膜。
[0025]优选的，步骤c中，超滤浓缩时，待滤余液体积为所述第二滤液体积的30％～40％时，停止浓缩。
[0026]优选的滤液体积，有利于提高蜂毒肽的纯度和收率，同时，还有利于提高后续高效液相制备色谱分离纯化的效率。
[0027]优选的，步骤c中，超滤的压力为0.4MPa～0.8MPa。
[0028]优选的操作压力，既可使杂质具有较高的透过率又具有较高的膜通量，同时还可避免压力过大导致的膜污染，提高超滤效率。
[0029]优选的，步骤d中，所述聚苯乙烯微球的粒径为20μm，孔径为
[0030]优选的，步骤d中，所述梯度洗脱的顺序为：
[0031]0min流动相A 65％～60％，流动相B 35％～40％；
[0032]15min流动相A 50％～45％，流动相B 50％～55％。
[0033]优选的，步骤d中，流速为280mL/min～320mL/min。
[0034]优选的，步骤d中，所述流动相A中三氟乙酸的体积百分含量为0.05％
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0.2％。
[0035]优选的，步骤d中，所述流动相B中三氟乙酸的体积百分含量为0.05％
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0.2％。
[0036]在高效液相制备色谱分离纯化过程中，各色谱条件的选择及其组合很重要，其直接影响各组分之间的分离度以及出峰时间等。本专利技术优选的色谱条件，有利于将蜂毒肽与杂质进行有效分离，在较短的时间内取得较好的分离效果。
[0037]优选的，步骤e中，超滤浓缩时，待滤余液体积与步骤c中所得蜂毒超滤液体积相同时，停止浓缩。
[0038]优选的滤余液体积有利于后续对蜂毒肽进行冻干，缩短冻干时间，并获得物理形态良好、表面平整的蜂毒肽产品。
[0039]优选的，步骤e中，超滤的压力为0.4MPa～0.8MPa。
[0040]优选的操作压力，可提高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高纯度蜂毒肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤a，将蜂毒粗品加入纯化水中，分散均匀，离心，得蜂毒离心液；步骤b，调节所述蜂毒离心液的pH为3.0～4.0，静置1h～2h，过滤，得第一滤液；然后调节所述第一滤液的pH为4.5～5.5，过滤，得第二滤液；步骤c，将所述第二滤液用截留分子量500Da～1000Da的超滤膜进行超滤浓缩，收集滤余液，得蜂毒超滤液；步骤d，将所述蜂毒超滤液经反相高效液相制备色谱进行分离纯化，收集目标组分，合并蜂毒肽HPLC纯度大于99％的洗脱液；其中，所述制备色谱柱为DAC
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100，填料为聚苯乙烯微球，流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为含三氟乙酸的甲醇溶液或含三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脱；步骤e，将所述蜂毒肽洗脱液用截留分子量500Da～1000Da的超滤膜进行超滤浓缩，收集滤余液，冻干，得蜂毒肽产品。2.如权利要求1所述的高纯度蜂毒肽的制备方法，其特征在于，步骤a中，所述蜂毒粗品与纯化水的质量比为1：8～10。3.如权利要求1所述的高纯度蜂毒肽的制备方法，其特征在于，步骤a中，离心的转速为4000r/min～6000r/min，离心时间为15min～30min。4.如权利要求1所述的高纯度蜂毒肽的制备方法，其特征在于，步骤c中，超滤浓缩时，待滤余...

【专利技术属性】
技术研发人员：李丽红，王彩肖，张雪霞，任风芝，刘建芬，张向彬，胡卫国，周捷，魏松波，高彩杰，石景曼，张彦，
申请(专利权)人：华北制药华坤河北生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：