鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及应用方法技术

本发明专利技术涉及一种鹅星状病毒（GoAstV）、鹅细小病毒（GPV）与鹅嵌杯病毒（GoCV）多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及其应用方法，所述试剂盒包括反转录混合液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照，本发明专利技术建立了鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒纳米PCR检测应用方法，并对该多重纳米PCR反应体系进行了优化，确定了引物浓度、退火温度、rTaq DNA聚合酶浓度、纳米粒子直径、纳米粒子浓度，使得GoAstV、GPV、GoCV三种病毒的扩增效果更佳；该方法具有灵敏度高、特异性好、稳定性高，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间﹐能彻底解决GoAstV、GPV、GoCV混合感染的诊断问题，适合临床实验室的快速检测。的快速检测。的快速检测。

【技术实现步骤摘要】
鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及应用方法


[0001]本专利技术涉及动物疫病分子生物学诊断领域，具体涉及一种鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及其应用方法。

技术介绍

[0002]近年来，全球新的水禽疫病不断出现，是导致水禽业损失惨重的一个重要原因。因此，建立一种快速检测水禽新发和再现变异病毒疾病的防控具有十分重要的意义。自2017年以来，在中国的许多省份，如安徽、山东、江苏、广东、辽宁、黑龙江、江西和河南等省份发现了越来越多的与星状病毒相关的鹅痛风疾病病例，死亡率高达50％，而新型鹅星状病毒(goose astroviruses,GoAstV)可以通过垂直传播，给预防和控制该疾病带来了更大的挑战。GoAstVs的基因组约为 7.0kb，包括一个5'非翻译区、三个开放阅读框(ORF1a、ORF1b和ORF2)、一个3'非翻译区和一个poly(A)尾部。ORF1a和ORF1b编码非结构蛋白，对病毒的转录和复制很重要；ORF2编码病毒的衣壳蛋白，为病毒的结构蛋白，与病毒的趋向性、中和表位和血清型的区分密切相关，对病毒生物学功能至关重要。ORF1b 为鹅星状病毒最保守基因，因此可以作为该病毒诊断的候选基因。
[0003]2008年，中国首次发现由新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus
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relatedvirus,N
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GPV)引起，以鹅软脚、嘴短和生长障碍为特征的临床症状。该病自2014 年在我国江苏、安徽、山东等地陆续报道过。被N
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GPV感染的鸭群10％以上会受到生长影响，但病死率相对较低，不超过3％，而受病毒感染的鸭其淘汰率却在80％以上，给鸭业造成巨大的经济损失。N
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GPV属于细小病毒，细小病毒亚科依赖病毒属，单链DNA病毒，无囊膜，二十面体对称,衣壳由32个管状壳粒组成。基因组大小约为5.1kb，两端存在可形成发夹结构的末端倒置重复序列 (ITR)，主要包含左右两个开放阅读框(ORF)，分别编码非结构蛋白(NS)和衣壳蛋白(VP)，其中非结构蛋白区域相对保守稳定，常被用做病原检测的基因。
[0004]嵌杯病毒科的成员是一类无囊膜的单链正链RNA病毒。该科中的一些成员是危害人类和动物健康的重要病原，如诺如病毒和札幌病毒可引发人的急性胃肠炎，猫嵌杯病毒能引发猫呼吸系统疾病，兔出血热病毒能引发兔的致死性疾病。在家禽业，嵌杯病毒可感染鸡、火鸡、金翅雀、雉鸡和白鸥等家禽，并可导致雉鸡肠炎。2016年张大丙等利用宏基因组测序的方法从肠炎患鹅的肠道病料样品中检测到一种新基因型水禽嵌杯病毒，与Nacovirus属成员NS蛋白的同源性仅为31％～34％。2018年至今，研究者从患有痛风的鹅中相继检测出一种新的GoCV 株，该病毒株与鹅肠炎型GoCV H146株同源性很高，而国内对GoCV鹅群的发病特点、传播途径及流行趋势等方面的研究还处于起步阶段。因此，采用合适的检测方法加强对GoCV的流行病学监控，对鹅病毒性肠炎与痛风的早期防治具有重要意义。
[0005]考虑到这三种新发病毒均能引起鹅群发生疾病，最近越来越多的研究表明，这三种病毒在临床上常呈混合感染，为疾病的诊断带来巨大的挑战。目前，三种病毒的检测方法主要包括：病原分离、血清抗体检测及病毒核酸检测等方法。其中病原分离存在工作量大、
耗时长、分离困难等缺点，不便于病原的快速检测和开展大规模流行病学调查；抗体检测方法包括经典的病毒中和试验、琼脂免疫扩散试验、竞争ELISA等，虽然以上血清抗体检测方法可同时进行大量样品的检测，但是血清抗体的产生相对于病毒感染存在一定的滞后性，因此不利于疫病的早期诊断和防控，例如中国专利技术专利申请CN108802382B公开了一种鹅星状病毒抗体的ELISA试剂盒及制备方法。而单重检测技术已不能满足临床大批量检测的需求，而多重PCR技术能够在一个反应体系中同时检测多个临床样品，短时间内高效率鉴别检测几种病原，特别适合混合感染样品中多个病原的检测，综上考虑本研究建立了可同时检测这三种病毒的多重PCR检测技术，并用于临床样本检测。由于GoAstV、GPV和GoCV引起猪群发病的症状类似，因此，专利技术一种快速鉴别GoAstV、GPV和GoCV感染的诊断试剂盒，为临床快速确诊相应疾病，具有重要的现实意义。
[0006]随着人和动物新发疾病的发展越来越复杂，临床实践中各种疾病的早期诊断对体外诊断技术的灵敏度、检测限、检测速度等性能指标提出了越来越高的要求，这使得许多传统的、常规的体外诊断技术逐渐不能满足疾病诊断的需要。同时，随着我国建设的展开和对外开放的进一步加深，我国防控输入性疾病和对外医疗援助的难度与需求也空前增高，不同的应用环境也对实验诊断技术的分析速度、检测成本、操作难度等提出了各种各样的要求。而目前，并没有出现同时具备良好敏感性、特异性和稳定性的多重纳米PCR方法能同时检测鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒的技术应用。

技术实现思路

[0007]针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及其应用方法，该鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR诊断试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高、其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床控制GoAstV、GPV和GoCV感染提供有力的技术手段。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现。
[0009]本专利技术提供了一种鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对，所述引物对包括GoAstV
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F上游引物、GoAstV
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R下游引物、GPV
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F 上游引物、GPV
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R下游引物、GoCV
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F上游引物、GoCV
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R下游引物，并且所述GoAstV
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F上游引物的序列为：5'
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GTTTGAGCAGGACCAGAATGA
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3'：所述GoAstV
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R下游引物的序列为：5'
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GCCATAGCAAATCATGGTGAC
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3'：所述GPV
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F上游引物的序列为：5'
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GCCTTTATTTACTGCTGCTGCT
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3'：所述GPV
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R下游引物的序列为：5'
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CCCACCAAATCAGCATCTTATCA
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3'；所述GoCV
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F上游引物的序列为：5'
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TGCATCTGGGACGAATTTGACAC
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3'：所述GoCV
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R下游引物的序列为：5'
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CAGTGAGAGCACAAGGTGTG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对，其特征在于，所述引物对包括GoAstV
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F上游引物、GoAstV
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R下游引物、GPV
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F上游引物、GPV
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R下游引物、GoCV
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F上游引物、GoCV
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R下游引物，并且所述GoAstV
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F上游引物的序列为：5'
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GTTTGAGCAGGACCAGAATGA
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3'：所述GoAstV
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R下游引物的序列为：5'
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GCCATAGCAAATCATGGTGAC
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3'：所述GPV
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F上游引物的序列为：5'
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GCCTTTATTTACTGCTGCTGCT
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3'：所述GPV
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R下游引物的序列为：5'
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CCCACCAAATCAGCATCTTATCA
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3'；所述GoCV
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F上游引物的序列为：5'
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TGCATCTGGGACGAATTTGACAC
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3'：所述GoCV
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R下游引物的序列为：5'
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CAGTGAGAGCACAAGGTGTGA
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3'。2.一种含有权利要求1所述的鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对的多重纳米PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于诊断GoAstV、GPV、GoCV的单一感染或混合感染。3.根据权利要求2所述的试剂盒，所述试剂盒含有反转录混合液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述反转录混合液包含PrimeScript IV Rtase，RNase Inhibitor，Random 6mers，dNTP Mixture，反转录PrimeScript IV Buffer(Mg
+2
plus)及ddH2O；扩增反应混合液包含PCR Buffer(Mg
+2
plus)，dNTP Mixture，权利要求1所述的GoAstV
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F上游引物、GoAstV
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R下游引物、GPV
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F上游引物、GPV
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R下游引物、GoCV
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F上游引物和GoCV
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R下游引物，ddH2O，rTaq DNA聚合酶，金纳米粒子和ddH2O；阴性对照为ddH2O；阳性对照为GoAstV、GPV和GoCV阳性质粒混合物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述反转录混合液包含5
×
PrimeScript IV Buffer(Mg
+2
plus)、RNase Inhibitor(40U/μl)、Random 6mers(10μM)、dNTP Mixture(10mM)、PrimeScript IV RTase反转录酶(200U/μl)和...

【专利技术属性】
技术研发人员：张帆帆，李海琴，韦启鹏，杨群，康昭风，谭美芳，曾艳兵，谭佳，
申请(专利权)人：江西省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：