同种异体T细胞及其制备和应用制造技术

本发明专利技术属于细胞免疫治疗领域，具体涉及工程改造的同种异体T细胞、其制备及应用。所述T细胞可同时表达下调细胞表面TCR/CD3复合物的多肽、下调细胞表面HLA-I类分子表达的功能蛋白和治疗用蛋白。白和治疗用蛋白。

【技术实现步骤摘要】
同种异体T细胞及其制备和应用


[0001]本专利技术属于细胞免疫治疗领域，具体涉及工程改造的同种异体T细胞、其制备及应用。

技术介绍

[0002]随着肿瘤治疗的发展，嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor-T，CAR-T)免疫疗法逐渐成为备受关注的治疗手段。CAR-T细胞所表达的嵌合抗原受体(CAR)一般包含胞外抗原结合域、跨膜域和胞内信号传导域。通常CAR-T细胞是由患者自体T细胞经CAR基因转导并扩增而来，最后再回输到该患者体内。CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，而不受主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)的限制。目前，美国FDA已经批准了两款自体CAR-T细胞产品上市，分别是诺华的Kymriah和凯特的YesCAR-Ta，用于难治性复发性非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病的治疗。相关临床试验证明，CAR-T作为完全个性化的活细胞药物极具抗肿瘤潜力(Maude et al.2018；Park et al.2018；Schuster et al.2017)。
[0003]上述两款CAR-T药物的制备及回输策略均是采集患者自体的外周血，分离得到T细胞，通过病毒载体将CAR的编码基因整合到T细胞的基因组上，然后进行扩大培养，最后回输到患者体内。这种完全个体化的CAR-T细胞生产不仅生产周期长，成本高，而且也给回输治疗带来许多不确定因素。例如，分离得到的T细胞数量不足或功能失常导致的CAR-T细胞制备失败、细胞制备中患者疾病快速进展而失去治疗窗口等。因此，CAR-T领域的一个共同期待是健康供者来源的即用型(off-the-shelf)同种异体(即通用型)CAR-T细胞，以有效避免或解决上述生产和治疗相关问题，并极大地降低生产成本。
[0004]为了有效制备同种异体CAR-T，需要解决2个问题：
①
因为异体T细胞表面的TCR(T cell receptor，TCR)会识别患者的异体抗原，从而导致同种异体T细胞输入带来的移植物抗宿主反应(graft-versus-host disease，GVHD)；
②
宿主的免疫系统会识别异体细胞表面的HLA(human leukocyte antigen)，从而导致输入的异体T细胞被快速清除，影响通用型CAR-T疗效。
[0005]目前制备通用型CAR-T的方式是通过基因编辑的方式敲除同种异体CAR-T细胞表面的TCR以及HLA-I类分子的表达，以减少GVHD和宿主排斥。已报道多种基因敲除编辑技术(zinc-finger nucleases，ZFN；transcription activator-like effector nucleases，TALENs；clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)在通用型CAR-T方面的应用(Provasi et al.2012；Berdien et al.2014；Ren et al.2017)。然而至今，仍只有非常有限数目的同种异体CAR-T的临床案例报道(Qasim et al.2017)。基于基因编辑的同种异体CAR-T临床研究进展缓慢的主要原因可能来源于基因编辑存在的安全隐患(例如脱靶导致错误的基因编辑)，基因编辑可能降低T细胞的体内持久性降低，以及生产制备中遇到的障碍(如工艺步骤繁多，对T细胞的损伤较大等)。而且，虽然通过基因编辑方式敲除异体T细胞表面的HLA-I能解决患者一部分的排斥反应，但完全敲除HLA-I的异体
L2-A-L1-B，C-L2-B-L1-A，或B-L1-C-L2-A。
[0016]在一个或多个实施方案中，第一多肽编码序列A包含内质网滞留肽的编码序列并且第二多肽编码序列B不包含内质网滞留肽的编码序列，并且各序列在所述核酸分子中的5
’
至3
’
顺序为：A-L1-B-L2-C，A-L1-C-L2-B，B-L2-A-L1-C，B-L2-C-L1-A，B-L1-C-L2-A，B-L2-C-L2-A，C-L2-A-L1-B，C-L2-B-L1-A，C-L1-B-L2-A，或C-L2-B-L2-A，或
[0017]在一个或多个实施方案中，第一多肽编码序列A不包含内质网滞留肽的编码序列并且第二多肽编码序列B包含内质网滞留肽的编码序列，并且各序列在所述核酸分子中的5
’
至3
’
顺序为：B-L1-A-L2-C，B-L1-C-L2-A，A-L2-B-L1-C，A-L2-C-L1-B，A-L1-C-L2-B，A-L2-C-L2-B，C-L2-B-L1-A，C-L2-A-L1-B，C-L1-A-L2-B，或C-L2-A-L2-B。
[0018]在一个或多个实施方案中，L2与其5
’
和/或3
’
的多肽编码序列处于同一表达框内。
[0019]在一个或多个实施方案中，L1与其5
’
和/或3
’
的多肽编码序列不处于同一表达框内。
[0020]本专利技术第一方面还提供一种核酸分子，选自(1)包含第一多肽编码序列A、第二多肽编码序列B、第三多肽编码序列C、第一接头L1和第二接头L2的多核苷酸序列，所述三种多肽的编码序列通过所述两种接头连接形成具有如下5
’
至3
’
顺序的结构：多肽编码序列-接头-多肽编码序列-接头-多肽编码序列，和(2)(1)的互补序列或片段。
[0021]在一个或多个实施方案中，第一多肽、第二多肽和第三多肽分别选自下调细胞表面TCR/CD3复合物的多肽、下调细胞表面HLA-I类分子表达的功能蛋白和治疗用多肽。
[0022]在一个或多个实施方案中，第一多肽是下调细胞表面TCR/CD3复合物的多肽。
[0023]在一个或多个实施方案中，第二多肽是下调细胞表面HLA-I类分子表达的功能蛋白。
[0024]在一个或多个实施方案中，第三多肽是治疗用多肽；优选地，治疗用多肽是嵌合抗原受体。
[0025]在一个或多个实施方案中，第一接头是IRES或2A肽编码序列。
[0026]在一个或多个实施方案中，第二接头是IRES或2A肽编码序列。
[0027]在一个或多个实施方案中，第一接头L1与其5
’
和/或3
’
的多肽编码序列不处于同一表达框内。在一个或多个实施方案中，第二接头L2与其5
’
和/或3
’
的多肽编码序列处于同一表达框内。在一个或多个实施方案中，第一接头L1和第二接头L2至少一个是2A肽编码序列。在一个或多个实施方案中，第一接头L1是IRES并且第二接头L2是2A肽编码序列。
[0028]在一个或多个实施方案中，2A肽是F2A、P2A、T2A或E2A肽。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸分子，选自：(1)包含第一多肽编码序列A、第二多肽编码序列B、第三多肽编码序列C、两个接头的多核苷酸序列，其中，所述三种编码序列和所述两个接头在所述核酸分子中的5
’
至3
’
顺序为：多肽编码序列-接头-多肽编码序列-接头-多肽编码序列，所述A或B或C在其3
’
末端区域含有内质网滞留肽的编码序列，并且所述内质网滞留肽的羧基端的接头不是2A肽；和(2)(1)的互补序列。2.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，A编码下调细胞表面TCR/CD3复合物的多肽，B编码下调细胞表面HLA-I类分子表达的功能蛋白，C编码治疗用多肽；优选地，治疗用多肽是嵌合抗原受体。3.如权利要求1或2所述的核酸分子，其特征在于，所述两个接头包含一个第一接头L1和一个第二接头L2，或两个第二接头L2，其中第一接头L1是IRES核苷酸序列，第二接头L2是2A肽编码序列，优选地，2A肽是F2A、P2A、T2A或E2A肽。4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，第一多肽编码序列A和第二多肽编码序列B中至少一个包含所述内质网滞留肽的编码序列，优选地，第一多肽编码序列A和第二多肽编码序列B分别包含内质网滞留肽的编码序列，并且各序列在所述核酸分子中的5
’
至3
’
顺序为：A-L1-C-L2-B，C-L2-A-L1-B，C-L2-B-L1-A，或B-L1-C-L2-A；或第一多肽编码序列A包含内质网滞留肽的编码序列并且第二多肽编码序列B不包含内质网滞留肽的编码序列，并且各序列在所述核酸分子中的5
’
至3
’
顺序为：A-L1-B-L2-C，A-L1-C-L2-B，B-L2-A-L1-C，B-L2-C-L1-A，B-L1-C-L2-A，B-L2-C-L2-A，C-L2-A-L1-B，C-L2-B-L1-A，C-L1-B-L2-A，或C-L2-B-L2-A，或第一多肽编码序列A不包含内质网滞留肽的编码序列并且第二多肽编码序列B包含内质网滞留肽的编码序列，并且各序列在所述核酸分子中的5
’
至3
’
顺序为：B-L1-A-L2-C，B-L1-C-L2-A，A-L2-B-L1-C，A-L2-C-L1-B，A-L1-C-L2-B，A-L2-C-L2-B，C-L2-B-L1-A，C-L2-A-L1-B，C-L1-A-L2-B，或C-L2-A-L2-B，优选地，L2与其5
’
和/或3
’
的多肽编码序列处于同一表达框内，优选地，L1与其5
’
和/或3
’
的多肽编码序列不处于同一表达框内。5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，下调细胞表面TCR/CD3复合物的多肽是抗体或其抗原结合片段，或与所述抗体或其抗原结合片段具有至少90％序列相同性并保留所述抗体或抗原结合片段的抗原结合活性的突变体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区具有下述HCDR：如SEQ ID NO:3所示的HCDR1：GYKFTSYV，如SEQ ID NO:9所示的HCDR2：INX1X2X3DVT，其中X1，X2，X3为任意氨基酸，如SEQ ID NO:15所示的HCDR3：AX4GX5X6YDYDGFVY，其中X4，X5，X6为任意氨基酸，所述轻链可变区具有下述LCDR：如SEQ ID NO:6所示的LCDR1：SSVSY，如SEQ ID NO:7所示的LCDR2：DTS，如SEQ ID NO:22所示的LCDR3：QQWX7X8X9X
10
X
11
T，其中X7，X8，X9，X
10
，X
11
为任意氨基酸，或所述重链可变区具有下述HCDR：如SEQ ID NO:54所示的HCDR1：GYTFISYT，如SEQ ID NO:60所示的HCDR2：X
12
X
13
X
14
X
1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李俊，张鹏潮，何玲，江雨辰，
申请(专利权)人：苏州方德门达新药开发有限公司，
类型：发明
国别省市：