一种有机溶剂耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种有机溶剂耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及其制备方法，属于酶工程和基因工程技术领域。本发明专利技术构建了两个有机溶剂(二甲基亚砜和乙醇)耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体。以染料木素为例，将这两个突变体运用在对染料木素的糖基化反应，结果显示，T599H/N600S/Y601G和T599D/N600D/Y601H产生的长链糖基化产物特异性明显优于野生型WT，分别是野生型的2.1倍及2.5倍。本发明专利技术获得了两个有机溶剂耐受性提高的环糊精糖基转移酶突变体，促进了糖基转移酶有机反应体系中的酶促效率，有助于拓展CGTase的工业应用范围，具有极大的应用前景。具有极大的应用前景。具有极大的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种有机溶剂耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及其制备方法


[0001]本专利技术涉及一种有机溶剂耐受性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及其制备方法，属于酶工程和基因工程


技术介绍

[0002]环糊精糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase，简称CGTase，EC 2.4.1.19)，属于α
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淀粉酶家族，已被证实是一种多功能的酶，具有多种转糖基活力，包括环化、歧化、耦合活力以及部分水解活力。其特征反应的产物环糊精因其独特的疏水空腔结构，能有效地改善疏水客体在水相中的溶解与分布问题，在食品、化工、医药、纺织等多个领域都得到了广泛的应用，环糊精糖基转移酶也因此引起了大量研究者的关注。
[0003]随着研究的不断深入，对于环糊精糖基转移酶的结构，催化机理等都有了较好的认识。目前对于环糊精糖基转移酶的研究主要集中在两个方面：一是新来源的环糊精糖基转移酶的挖掘及表达优化；二是利用基因工程、分子改造等技术定向进化提高酶学特性；另外，也涉及酶固定化，多酶偶联等常规研究方向。环糊精糖基转移酶因其多样的糖基化活力，已被用于多种化合物的转糖基反应，如甜菊苷、芦丁、染料木素等。糖基化处理有效解决了这些物质在实际应用中溶解性差、不易储存、不稳定等多种问题，且糖基化产物多数保持了物质本身的优良性质和价值，从而在食品、化工等多个领域得到了较好的应用。
[0004]但在实际应用中，直接依靠挖掘的天然环糊精糖基转移酶往往很难满足生产要求。究其原因，天然酶多数都存在酶活低，不稳定，底物混杂性差等问题，且由于环糊精糖基转移酶复杂的催化机理，常产生多种产物，产物特异性差，因此，目前对于该酶的分子改造多集中于催化活性，热稳定性，专一性等方面，并取得了不错的进展。然而，对于酶学反应，其催化效率除酶本身外，与酶所处环境也有很大的关系。在工业生产中，有机溶剂的使用是极为重要的一环，很多疏水底物的生物转化都依赖于有机溶剂，但有机溶剂往往对多数酶存在不利影响，使酶活性降低甚至失活，严重限制了生产效率。
[0005]以染料木素为例，它是一类高活性功能的大豆异黄酮类物质，具有多种药理价值，包括抗癌、抗骨质疏松、预防心血管疾病等，但这类物质具有强疏水性，几乎不溶于水，仅能溶解在二甲基亚砜(DMSO)等极性有机溶剂中，故极大限制了其在医药领域的进一步开发利用，用环糊精糖基转移酶对其进行糖基化修饰后可以有效解决水不溶性难题，产物的水溶性较之前提高上千乃至上万倍。但天然的环糊精糖基转移酶在有机溶剂环境中的酶活及酶稳都会受到极大影响，因此，为了突破这一瓶颈，通过分子改造策略提高环糊精糖基转移酶的有机溶剂耐受性具有极大的意义。

技术实现思路

[0006]为了提高现有的环糊精糖基转移酶对有机溶剂的耐受力，本专利技术提供了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄
糖基转移酶的第599位、第600位、第601位的氨基酸同时突变得到的。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于软化类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第599位的苏氨酸突变为组氨酸，同时将第600位的天冬酰胺突变为丝氨酸，同时将第601位的酪氨酸突变为甘氨酸得到；命名为T599H/N600S/Y601G。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第599位的苏氨酸突变为天冬氨酸，同时将第600位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，同时将第601位的酪氨酸突变为组氨酸得到；命名为T599D/N600D/Y601H。
[0011]本专利技术还提供了一种编码上述突变体的基因。
[0012]本专利技术还提供了一种携带上述基因的重组载体。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述载体为：pET系列载体、pUT系列载体或pBAD系列载体。
[0014]本专利技术还提供了一种表达上述突变体，或携带上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞是以真菌或细菌为宿主细胞。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为：大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。
[0017]本专利技术还提供了一种制备所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的方法，所述方法包括：
[0018]先设计定点突变的引物，待提取含有所述环糊精葡萄糖基转移酶基因的质粒后，以此作为模板进行全质粒PCR，获得携带突变基因的重组质粒，将其转入宿主菌中进行培养，诱导表达后离心破碎，收集上清液，即为粗酶液。
[0019]本专利技术还提供了一种重组大肠杆菌，表达了上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pET
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28a(+)为表达载体。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以E.coli BL21(DE3)为表达宿主。
[0022]本专利技术还提供了上述重组大肠杆菌的构建方法，具体步骤如下：
[0023]1)首先设计引物得到大量的环糊精糖基转移酶突变体基因；
[0024]2)将克隆得到的基因片段连接到线性化的表达载体pET
‑
28a(+)上，得到重组表达质粒pET
‑
28a(+)
‑
突变体；
[0025]3)将步骤2)中获得的重组表达质粒转入到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)得到基因工程菌，得到能够表达环糊精糖基转移酶突变体的重组大肠杆菌。
[0026]本专利技术还提供了一种提高环糊精葡萄糖基转移酶对有机溶剂的耐受性的方法，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第599位的苏氨酸突变为组氨酸，同时将第600位的天冬酰胺突变为丝氨酸，同时将第601位的酪氨酸突变为甘氨酸；
[0027]或，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第599位的苏氨
酸突变为天冬氨酸，同时将第600位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，同时将第601位的酪氨酸突变为组氨酸。
[0028]在本专利技术的一种实施方式中，所述有机溶剂为：二甲基亚砜DMSO和/或乙醇。
[0029]本专利技术还提供了一种生产长链糖基化染料木素的方法，所述方法为，向含有可溶性淀粉和染料木素的反应体系中加入上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，获得长链糖基化染料木素。
[0030]在本专利技术的一种实施方式中，所述底物可溶性淀粉的添加量为：30～40g/L。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第599位、第600位、第601位的氨基酸同时突变得到的。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第599位的苏氨酸突变为组氨酸，同时将第600位的天冬酰胺突变为丝氨酸，同时将第601位的酪氨酸突变为甘氨酸得到；或，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第599位的苏氨酸突变为天冬氨酸，同时将第600位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，同时将第601位的酪氨酸突变为组氨酸得到。3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。4.携带权利要求3所述基因的重组载体。5.表达权利要求1或2所述突变体，或携带权利要求3所述基因，或携带权利要求4所述重组载体的重组细胞。6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以细菌或真菌为宿主细胞。7.一种提高环糊精葡萄糖基转移酶对有机溶剂的耐受性的...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩瑞枝，姜钰琳，樊朝悦，易灵凤，倪晔，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：