基于脐带间充质干细胞外泌体的毛囊生成促进液制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于脐带间充质干细胞外泌体的毛囊生成促进液制备方法，包括以下步骤：S1：脐带组织样本消毒并预处理，剪碎成组织碎块，保存备用；S2：加入改性DMEM培养液，置于恒温培养箱内，每隔2d半量换液一次，三次后每隔3d全量换液一次；S3：进行传代扩增培养；S4：提取得到脐带间充质干细胞外泌体；S5：收集第五代脐带间充质干细胞；S6：将步骤S4中得到的脐带间充质干细胞外泌体、步骤S5中得到的第五代脐带间充质干细胞以及，毛乳头细胞混合培养得到毛囊生成促进液。本发明专利技术可以有效改善毛囊退化、萎缩、脱发、斑秃等症状的毛囊生成促进液，对促进头发再生效果显著且更加持久。对促进头发再生效果显著且更加持久。

【技术实现步骤摘要】
基于脐带间充质干细胞外泌体的毛囊生成促进液制备方法


[0001]本专利技术涉及脐带间充质干细胞外泌体提取
，具体是涉及基于脐带间充质干细胞外泌体的毛囊生成促进液制备方法。

技术介绍

[0002]脐带间充质干细胞是以人脐带血血清为主体的培养体系的脐带间充质干细胞培养扩增的方法，应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人脐带间充质干细胞，培养的细胞具有间充质干细胞的基本特性，为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据，在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。
[0003]外泌体(Exosome)是一种直径为30
‑
100nm的纳米级脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质。外泌体由细胞分泌释放出来，在血液等体液内传播，最后又可被其他细胞吞噬，是细胞间通讯的重要介质。脐带间充质干细胞外泌体分离培养方法一般为：取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净后，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至1mm3大小，加入α
‑
MEM培养液置于37℃，5％的CO2培养箱培养，培养液中含10％FBS，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素。脐带组织培养5
‑
7天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形，一周后，细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，待细胞长满后，用0.25％胰蛋白酶消化传代。
[0004]后也有一些专利对于其制备方法进行了改进，例如专利CN111920828A公开了一种基于脐带间充质干细胞用于毛发再生的冻干粉、制备方法、生发营养液及毛发再生方法。该冻干粉的制备方法包括：采用脐带间充质干细胞制备冻干粉原液；将冻干保护剂与冻干粉原液混匀，得到中间液；将所述中间液在预设冻干条件下进行冻干，以得到所述冻干粉。所制得的冻干粉和生发营养液对于促进人体毛囊修复以及促进毛发再生中的至少一者具有显著的效果，有助于缓解脱发的趋势和/或改善毛发状态。但制备方法复杂，且可能会对人体皮肤产生负作用。
[0005]因此，需要对脐带间充质干细胞外泌体混合液及制备方法进行改进，提高毛囊生成速度且减少副作用。

技术实现思路

[0006]针对上述存在的问题，本专利技术提供了一种基于脐带间充质干细胞外泌体的毛囊生成促进液制备方法。
[0007]本专利技术的技术方案是：
[0008]基于脐带间充质干细胞外泌体的毛囊生成促进液制备方法，包括以下步骤：
[0009]S1：脐带组织样本消毒并预处理，去除胶状物、脐带外膜及脐动静脉，剪成组织小段，使用无菌PBS溶液冲洗3次，剪碎成2
±
0.5mm3体积大小的组织碎块，置于超净培养皿中保存备用；
[0010]S2：加入组织碎块体积5
‑
8倍的改性DMEM培养液，震荡使组织碎块均匀分散在改性
DMEM培养液中，置于恒温培养箱内，通入CO2气体至其体积分数为5
‑
9％，每隔2d半量换液一次，三次后每隔3d全量换液一次；
[0011]S3：脐带间充质干细胞融合度达到80
‑
90％时，使用胰蛋白酶消化处理，并进行传代扩增培养；
[0012]S4：第三代脐带间充质干细胞融合度达到70
‑
80％时，更换无血清基础培养液继续培养，脐带间充质干细胞融合度达到85
‑
95％时，收集培养液上清液，得到含有脐带间充质干细胞外泌体的培养液，将其离心去除第三代脐带间充质干细胞及细胞碎片，保存备用，并继续对培养液超速离心提取得到脐带间充质干细胞外泌体，使用无菌PBS溶液重悬并于
‑
80℃条件下冻存备用；
[0013]S5：继续培养第三代脐带间充质干细胞至第五代脐带间充质干细胞融合度达到70
‑
80％时，收集第五代脐带间充质干细胞；
[0014]S6：将步骤S4中得到的脐带间充质干细胞外泌体、步骤S5中得到的第五代脐带间充质干细胞以及毛乳头细胞混合置于无血清基础培养液中培养，得到混合培养基，随后将一定质量比的胆固醇和卵磷脂混合，溶解于质量浓度为50％的三氯甲烷溶液中，蒸发干燥得到脂质体，随后加入混合培养基，超声分散得到毛囊生成促进液。
[0015]进一步地，所述步骤S1中消毒及预处理的具体步骤为：
[0016]S1
‑
1：将脐带组织样本浸泡在质量浓度为75％的乙醇溶液中消毒处理1
‑
2min；
[0017]S1
‑
2：将消毒处理后的脐带组织样本使用无菌PBS溶液冲洗1
‑
2次，去除残余血液。通过预处理的方式保证整个制备过程无菌且不会受到杂质的干扰。
[0018]进一步地，所述步骤S1中组织小段的长度为2
±
0.5cm。方便工作人员操作。
[0019]进一步地，所述步骤S2中改性DMEM培养液含体积分数10％的胎牛血清，其中，链霉素的质量浓度100g/L、青霉素的单位浓度100U/mL，羟脯氨酸的质量浓度23
‑
28mg/L，壳聚糖的质量浓度55
‑
60mg/L，pH为6.8
‑
7.2。该改性DMEM培养液营养成分丰富，符合生长速度快、附着性较差的脐带间充质干细胞的生长需要，可实现脐带间充质干细胞的快速增殖培养。
[0020]进一步地，所述步骤S2中恒温培养箱的温度为36.5
‑
37.5℃，湿度为饱和湿度。通过调节合适的温度湿度以及CO2浓度可以进一步的促进脐带间充质干细胞的增殖培养。
[0021]进一步地，所述步骤S3中胰蛋白酶质量浓度为2.5g/L，胰蛋白酶中掺有0.02％质量浓度的乙二胺四乙酸EDTA，传代比例为1：2
‑
3。将缠带比例控制在合理范围内，避免扩增过快或过慢。
[0022]进一步地，所述步骤S4中无血清基础培养液为无酚红α
‑
MEM培养基，其中，D
‑
葡萄糖的质量浓度为2250mg/L，L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺的质量浓度为380mg/L，丝氨酸的质量浓度为30
‑
33mg/L、所述色氨酸的浓度为8
‑
12mg/L，生物素的质量浓度为0.7
‑
1mg/L，维生素B12的质量浓度为0.02
‑
0.03mg/L，丙酮酸钠的浓度为15
‑
20mmol/L。该无血清基础培养液去除了酚红、赖氨酸，适用范围广，兼容性好。
[0023]进一步地，所述步骤S6中胆固醇和卵磷脂的质量比为7
‑
9：1，混合培养基、三氯甲烷与脂质体的体积比为1.25
‑
1.6：1：0.2，混合培养基中脐带间充质干细胞外泌体的质量浓度为500<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于脐带间充质干细胞外泌体的毛囊生成促进液制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：脐带组织样本消毒并预处理，去除胶状物、脐带外膜及脐动静脉，剪成组织小段，使用无菌PBS溶液冲洗3次，剪碎成2
±
0.5mm3体积大小的组织碎块，置于超净培养皿中保存备用；S2：加入组织碎块体积5
‑
8倍的改性DMEM培养液，震荡使组织碎块均匀分散在改性DMEM培养液中，置于恒温培养箱内，通入CO2气体至其体积分数为5
‑
9％，每隔2d半量换液一次，三次后每隔3d全量换液一次；S3：脐带间充质干细胞融合度达到80
‑
90％时，使用胰蛋白酶消化处理，并进行传代扩增培养；S4：第三代脐带间充质干细胞融合度达到70
‑
80％时，更换无血清基础培养液继续培养，脐带间充质干细胞融合度达到85
‑
95％时，收集培养液上清液，得到含有脐带间充质干细胞外泌体的培养液，将其离心去除第三代脐带间充质干细胞及细胞碎片，保存备用，并继续对培养液超速离心提取得到脐带间充质干细胞外泌体，使用无菌PBS溶液重悬并于
‑
80℃条件下冻存备用；S5：继续培养第三代脐带间充质干细胞至第五代脐带间充质干细胞融合度达到70
‑
80％时，收集第五代脐带间充质干细胞；S6：将步骤S4中得到的脐带间充质干细胞外泌体、步骤S5中得到的第五代脐带间充质干细胞以及毛乳头细胞混合置于无血清基础培养液中培养，得到混合培养基，随后将一定质量比的胆固醇和卵磷脂混合，溶解于质量浓度为50％的三氯甲烷溶液中，蒸发干燥得到脂质体，随后加入混合培养基，超声分散得到毛囊生成促进液。2.根据权利要求1所述的基于脐带间充质干细胞外泌体的毛囊生成促进液制备方法，其特征在于，所述步骤S1中消毒及预处理的具体步骤为：S1
‑
1：将脐带组织样本浸泡在质量浓度为75％的乙醇溶液中消毒处理1
‑
2min；S1
‑
2：将消毒处理后的脐带组织样本使用无菌PBS溶液冲洗1
‑
2次，去除残余血液。3.根据权利要求1所述的基于脐带间充质干细胞外泌体的毛囊生成促进液制备方法，其特征在于，所述步骤S1中组织小段的长度为2
±
0.5cm。4.根据权利要求1所述的基于脐带间充质干细胞外泌体的毛囊生成促进液制备方法，其特征在于，所述步骤S2中改性DMEM培养液含体积分数10％的胎牛血清，其中，链霉素的质量浓度100g/L、青霉素的单位浓度100U/mL，羟脯氨酸的质量浓度23
‑
28mg/L，壳聚糖的质...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄燕，王志伟，郑旭东，
申请(专利权)人：深圳市莱利赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：