一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂及制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂及制备方法和应用，所述外泌体制剂包括：脂肪间充质干细胞来源外泌体、miRNA‑27b、蒲公英组织液提取物、马齿苋提取物和光致亚胺交联水凝胶；制备方法包括以下步骤：S1：脂肪组织处理；S2：脂肪间充质干细胞培养；S3：脂肪间充质干细胞外泌体制备；S4：外泌体修饰；S5：抗炎型外泌体制剂制备；制备得到的抗炎型外泌体制剂应用于骨关节炎的治疗。总之，本发明专利技术具有材料先进、方法完善、炎症治疗效果好等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂及制备方法和应用
本专利技术属于医疗制剂
，具体是涉及一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂及制备方法和应用。
技术介绍
膝关节炎是一种以退行性病理改变为基础的疾患。多数膝关节炎患者初期症状较轻，若不接受治疗病情会逐渐加重。主要症状有膝部酸痛、膝关节肿胀、膝关节弹响等症状。膝关节僵硬、发冷也是膝关节炎的症状之一，以僵硬为主、劳累、受凉或轻微外伤而加剧，严重者会发生活动受限。外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。如今随着大量对其生物来源、其物质构成及运输、细胞间信号的传导以及在体液中的分布的研究发现外泌体具有多种多样的功能。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。近年来，干细胞疗法在再生医学领域的应用逐渐成为研究热点。有研究指出，骨髓间充质干细胞具有分化为多种细胞的潜能，在特定条件下可促进其向软骨细胞分化，并维持软骨细胞的功能和稳定性。干细胞疗法在再生医学领域表现出的极大潜力，一度被认为是修复软骨损伤最有希望的疗法。随着研究的逐渐深入，研究者认识到其治疗作用的发挥主要依赖于旁分泌作用。作为旁分泌机制过程中扮演重要角色的外泌体，具有稳定性好、靶向性强以及低免疫排斥性的优点，同时可一定程度避免干细胞疗法的致畸性和异常堆积等难题。不仅仅干细胞来源外泌体，其他细胞来源外泌体同样可通过其承载的生物活性分子作用于软骨细胞，调控软骨细胞功能，促进其增殖，抑制其凋亡，进而发挥保护软骨的作用，促使关节炎软骨损伤的修复。现有技术中，应用于膝关节抗炎的外泌体制剂没有系统的制备工艺，所以，本专利技术设计了一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂及制备方法和应用。
技术实现思路
针对上述存在的问题，本专利技术提供了一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂及制备方法和应用。本专利技术的技术方案是：一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂，按照重量份数计包括：脂肪间充质干细胞来源外泌体30-50份、miRNA-27b3-8份、蒲公英组织液提取物8-10份、马齿苋提取物3-5份和光致亚胺交联水凝胶10-20份。进一步地，所述蒲公英组织液提取物的提取工艺包括以下步骤：采集并收集蒲公英杆茎中的乳白色汁液，将乳白色汁液在离心机上以5000-8000r/min的转速离心分离，离心后取上清液，向上清液中加入与上清液质量比为4-6:1的氯化钠溶液浸提3-5h，得到浸提液，将浸提液进行超临界二氧化碳萃取循环，萃取结束后得到蒲公英组织液提取物，蒲公英组织液中具有抗炎因子，尤其对骨关节处炎症效果最好。进一步地，所述超临界二氧化碳萃取循环的二氧化碳流速为3-5m/s，萃取温度为39-42℃，萃取压力为13-15MPa，萃取时间120-160min，萃取得到的提取物有效成分高且活性高。进一步地，所述马齿苋提取物的提取工艺包括以下步骤：取新鲜马齿苋清洗并晾干，剪成1-3cm的小段后放入打浆机中，向打浆机中加入与马齿苋质量比为2-3:1的氯化钠溶液，开启打浆机将马齿苋打成浆液，将浆液在离心机中以6000-9000r/min的转速离心分离，分离后取上清液，将上清液用40-60℃的水蒸气蒸馏10-20min，冷却后得到马齿苋提取物，马齿苋提取物可以抑制炎症因子的表达，具有抗炎缓痛的功效。优选地，所述氯化钠溶液的质量浓度为5-30％。进一步地，所述miRNA-27b由间充质干细胞外泌体扩增、纯化得到，miRNA-27b可提高炎症环境下软骨细胞的增殖能力，抑制其凋亡。上述一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂的制备方法，包括以下步骤：S1：脂肪组织处理取脂肪组织一块，用PBS缓冲液冲洗脂肪组织3-5次后置于无菌操作皿中，用无菌剪将脂肪组织剪成3-5mm3的小块，剪的过程中剔除脂肪组织中的纤维膜和血管，向无菌操作皿中添加没过脂肪组织的PBS缓冲液浸泡2-3d，用PBS缓冲液再次冲洗干净后得到处理好的纯脂肪组织；S2：脂肪间充质干细胞培养将步骤S1得到的纯脂肪组织转移至无菌培养皿中，向无菌培养皿中添加没过纯脂肪组织的消解液，将无菌培养皿转移至恒温水浴培养箱中，于40-45℃条件下消解15-18h，得到脂肪消解液，将脂肪消解液接种于培养基中，在恒温培养箱中进行脂肪间充质干细胞培养，当脂肪间充质干细胞融合度达到80-90％时进行传代培养；S3：脂肪间充质干细胞外泌体制备选取培养至第4-5代的脂肪间充质干细胞于离心管中，预冷超速离心机内温度至0-3℃，将离心管置于超速离心机中300-400g离心8-10min除去细胞，取离心管中上清液于新离心管中，30000-35000g离心20-30min除去细胞碎片，取离心管中上清液过滤，除去细胞粒子，过滤后上清液于新离心管中，120000-125000g离心90-100min，除去离心管中的上清液，离心管底的沉淀物即为脂肪间充质干细胞外泌体；S4：外泌体修饰将步骤S3得到的脂肪间充质干细胞外泌体重悬于PBS缓冲液中，制备得到质量浓度为15-20mg/ml的外泌体悬液，向外泌体混悬液中按照质量份数比例加入miRNA-27b并震荡均匀，得到混悬液，向混悬液中加入培养液后放置在培养箱中培养12-24h，得到miRNA-27b修饰的脂肪间充质干细胞外泌体；S5：抗炎型外泌体制剂制备将步骤S4得到的miRNA-27b修饰脂肪间充质干细胞外泌体重悬于PBS缓冲液中，制备得到质量浓度为35-40mg/ml的修饰外泌体悬液，向修饰外泌体悬液中按照质量份数比例加入光致亚胺交联水凝胶、蒲公英组织液提取物和马齿苋提取物，35-38℃下水浴混合均匀，得到抗炎型外泌体制剂。优选地，所述PBS缓冲液的配制步骤为：将质量比为80:2:15:5的NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4充分溶解于去离子水中得到混合溶液，用HCl调节混合溶液pH至7.1-7.5，然后向混合溶液中继续添加去离子水定容即可。优选地，所述消解液由质量比为1:1:3:5的氯化钙、硫酸镁、脂酶、生理盐水配比得到。进一步地，将制备得到的抗炎型外泌体制剂应用于骨关节炎的治疗。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂及制备方法和应用，尤其适用于炎症环境下的软骨组织细胞修复使用，通过制备脂肪间充质干细胞来源外泌体来抑制炎症细胞的繁殖和存活，并且通过miRNA-27b修饰脂肪间充质干细胞来源外泌体，使脂肪间充质干细胞来源外泌体具有较强的修复能力，可抑制软骨细胞的凋亡，并且可以促进软骨细胞的增殖，同时在抗炎型外泌体制剂中添加具有抗炎作用的蒲公英组织液提取物和马齿苋提取物，进一步提高外泌体制剂的抗炎作用，以光致亚胺交联水凝胶为载体将外泌体制剂送至膝关节炎症处释放，增强治疗效果。总之，本专利技术具有具有材料先进、方法完善、炎症治疗效果好等优点。附图说明<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂，其特征在于，按照重量份数计包括：脂肪间充质干细胞来源外泌体30-50份、miRNA-27b 3-8份、蒲公英组织液提取物8-10份、马齿苋提取物3-5份和光致亚胺交联水凝胶10-20份。/n

【技术特征摘要】
1.一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂，其特征在于，按照重量份数计包括：脂肪间充质干细胞来源外泌体30-50份、miRNA-27b3-8份、蒲公英组织液提取物8-10份、马齿苋提取物3-5份和光致亚胺交联水凝胶10-20份。


2.根据权利要求1所述的一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂，其特征在于，所述蒲公英组织液提取物的提取工艺包括以下步骤：采集并收集蒲公英杆茎中的乳白色汁液，将乳白色汁液在离心机上以5000-8000r/min的转速离心分离，离心后取上清液，向上清液中加入与上清液质量比为4-6:1的氯化钠溶液浸提3-5h，得到浸提液，将浸提液进行超临界二氧化碳萃取循环，萃取结束后得到蒲公英组织液提取物。


3.根据权利要求2所述的一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂，其特征在于，所述氯化钠溶液的质量浓度为5-30％。


4.根据权利要求1所述的一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂，其特征在于，所述马齿苋提取物的提取工艺包括以下步骤：取新鲜马齿苋清洗并晾干，剪成1-3cm的小段后放入打浆机中，向打浆机中加入与马齿苋质量比为2-3:1的氯化钠溶液，开启打浆机将马齿苋打成浆液，将浆液在离心机中以6000-9000r/min的转速离心分离，分离后取上清液，将上清液用40-60℃的水蒸气蒸馏10-20min，冷却后得到马齿苋提取物。


5.根据权利要求4所述的一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂，其特征在于，所述氯化钠溶液的质量浓度为5-30％。


6.根据权利要求1所述的一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂，其特征在于，所述miRNA-27b由间充质干细胞外泌体扩增、纯化得到。


7.根据权利要求1所述的一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：脂肪组织处理
取脂肪组织一块，用PBS缓冲液冲洗脂肪组织3-5次后置于无菌操作皿中，用无菌剪将脂肪组织剪成3-5mm3的小块，剪的过程中剔除脂肪组织中的纤维膜和血管，向无菌操作皿中添加没过脂肪组织的PBS缓冲液浸泡2-3d，用PBS缓冲液再次冲洗干净后得到处理好的纯脂肪组织；
S2：脂肪间充质干细胞培养
将步骤S1得到的纯脂肪组织转移至无菌培养皿中，向无菌培养皿中添加没过纯脂肪组...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄燕，王志伟，郑旭东，
申请(专利权)人：深圳市莱利赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44