子宫内皮修复的脐血干细胞外泌体复合制剂的制备方法技术

本发明专利技术公开了子宫内皮修复的脐血干细胞外泌体复合制剂的制备方法，包括以下步骤：S1、取样；S2、梯度离心；S3、培养基培养；S4、外泌体分离；S5、复合制剂制备。本发明专利技术的脐血干细胞外泌体复合制剂的制备方法通过科学合理地设置工艺流程，达到取得完整外泌体的目的，通过对脐带血进行处理并梯度离心，从而收集活性较好的脐血干细胞，再通过外泌体分离得到结构较为完整的外泌体，避免外泌体中的RNA或蛋白等成分在分离过程中丢失，同时也在一定程度上节省了培养基的消耗。了培养基的消耗。

【技术实现步骤摘要】
子宫内皮修复的脐血干细胞外泌体复合制剂的制备方法


[0001]本专利技术涉及脐血干细胞外泌体制备及应用
，具体是涉及子宫内皮修复的脐血干细胞外泌体复合制剂的制备方法。

技术介绍

[0002]脐带血是指胎儿娩出，将脐带结扎并离断后，残留在胎盘和脐带中的血液。脐带血中含有大量的干细胞，包括造血干细胞和多种其他干细胞，统称为脐血干细胞。脐带血造血干细胞已经有30多年拯救生命的历史。目前还有多项脐带血在再生医学方面的临床研究，目的是利用脐带血干细胞促进机体组织和器官的损伤修复。
[0003]目前，脐血干细胞的作用机理已成为当今研究的热点，尤其是培养基中的生物活性因子，如外泌体和可溶性的因子等被广泛的开发研究，尤其是由脐血干细胞外泌体制备的复合制剂可以对各种人体组织进行损伤修复，抑制炎症反应，调节免疫系统等。同时，外泌体制剂相比细胞更具有优势，其稳定易保存且兼容性强不存在排斥各类反应，为许多疾病提供了新的启发，如减少心肌梗死的面积，促进肾脏的损伤修复，调节免疫应答等，脐血干细胞外泌体复合制剂有望成为未来干细胞治疗的又一新的方向。
[0004]子宫内皮是指构成哺乳类子宫内壁的一层。对雌激素和孕激素都起反应，因此可随着性周期(发情周期、月经周期)发生显著的变化。子宫内皮病变引发的疾病目前正呈多发趋势，影响了10—15％的女性。目前对于子宫内皮修复的治疗一般采取药物治疗和手术治疗，根据严重程度不同采取不同的治疗方法，而目前还少有将脐血干细胞外泌体为主要制剂用于治疗子宫内皮疾病。
[0005]此外，对于外泌体制剂的治疗机制还需进一步明确，同时对于外泌体制剂的制备方法及配方还需改进。专利CN107519207A公开了一种免疫抑制细胞制剂及其制备方法和应用，具体包括：Treg细胞、脐带间充质干细胞外泌体、脐血单个核细胞、脐血浆和医学上可接受的溶剂，以及所述免疫抑制细胞制剂在制备预防和治疗系统性红斑狼疮药物中的应用。同时还提供了上述免疫抑制细胞制剂的制备方法。该专利技术专利的有益效果在于Treg细胞和脐带间充质干细胞外泌体先发挥抑制机体免疫亢进、平衡机体免疫系统功能，脐血单个核细胞再发挥免疫调控作用，改善血液环境，从根本上解决免疫系统紊乱的问题。但是，该外泌体制剂的应用范围比较有限，针对性有待提高，对于外泌体的利用效果有待于进一步改进。

技术实现思路

[0006]针对上述存在的问题，本专利技术提供了一种子宫内皮修复的脐血干细胞外泌体复合制剂的制备方法
[0007]本专利技术的技术方案是：
[0008]子宫内皮修复的脐血干细胞外泌体复合制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0009]S1、取样：将脐带血放入容器中进行表面消毒处理，持续进行紫外线消毒，并向容
器中加入抗凝血剂和质量浓度为6％的羟乙基淀粉，混匀并去除红细胞；
[0010]S2、梯度离心：将所述容器密封后倒置静置60min去上清液保留沉淀细胞，再在10
‑
14℃温度下、150
‑
200g离心力条件下离心8
‑
10min去上清液保留沉淀细胞，使用注射器注入含有白细胞的血浆，在室温下、180
‑
220g离心力条件下离心8
‑
10min去上清液保留沉淀细胞，注入氯化钠注射液后混匀，在200
‑
220g离心力条件下离心8
‑
10min去上清液保留沉淀细胞即为脐血干细胞；
[0011]S3、培养基培养：将DMEM/F12培养基放入培养皿中，加入步骤S2得到的脐血干细胞，待脐血细胞增殖融合至80％后按照1:5的传代比进行传代，待第四代脐血细胞增殖融合至对数生长期时，去除培养基并使用磷酸盐缓冲液漂洗3次，随后加入处理后的DMEM培养基，继续培养24h，收集脐血干细胞培养基；
[0012]S4、外泌体分离：预冷离心机至0
‑
4℃，加入步骤S3中得到的脐血干细胞培养基在300
‑
350g离心力作用下离心8
‑
10min，去除细胞碎片保留上清液，将上清液转移至超速离心管中并加入磷酸盐缓冲液至离心前的重量，在29500
‑
30000g离心力作用下离心16
‑
20min，去除细胞碎片保留上清液，使用过滤器过滤，再转移至另一无菌消毒超速离心管中，在120000
‑
130000g离心力作用下离心90
‑
100min，去上清液保留管底脐血干细胞外泌体；
[0013]S5、复合制剂制备：取步骤S4中得到的脐血干细胞外泌体1
‑
5重量份，透明质酸2
‑
4重量份，苦参0.2
‑
0.6重量份，藏红花0.1
‑
0.5重量份以及椿白皮0.1
‑
0.3重量份，溶解于5
‑
7重量份的甘油溶剂中，加温至18
‑
24℃静置30min，再加入S4中得到的脐血干细胞外泌体1
‑
3重量份混匀，得到脐血干细胞外泌体复合制剂。
[0014]进一步地，所述步骤S1中在放入脐带血之前对容器瓶口使用爱尔碘擦拭2遍，去除红细胞的步骤为：加入抗凝血剂和质量浓度为6％的羟乙基淀粉后，混匀时间为5
‑
8min，在10
‑
14℃温度下、50g离心力作用下离心10min，静置15min分层清晰后，使用注射器匀速从容器中抽取红细胞。排除红细胞对收集的脐血干细胞的干扰。
[0015]更进一步地，所述去除红细胞的步骤中，使用注射器匀速从容器中抽取红细胞时抽取至分层界面距离容器底部2
‑
3cm。避免抽取过多的红细胞造成脐血干细胞的流失。
[0016]进一步地，所述步骤S1中脐带血为15重量份，抗凝血剂为2
‑
3重量份，羟乙基淀粉为1
‑
2重量份。制备比例可根据使用需要进行调节。
[0017]进一步地，所述步骤S2中含有白细胞的血浆为3
‑
4重量份，其中人血白蛋白占血浆总量的20
‑
25％，所述氯化钠注射液为2.5
‑
3重量份。该成分配比能够达到更好的分离效果。
[0018]进一步地，所述步骤S3中DMEM/F12培养基为5
‑
7重量份，DMEM培养基的处理方法为：将7重量份的DMEM培养基在120000g离心力的作用下离心12h，得到上清液，向上清液中加入1重量份的β
‑
磷酸甘油、0.4
‑
0.7重量份的地塞米松、0.1重量份的维生素C，混匀后再加入1
‑
1.3重量份的型I胶原酶，混匀5min得到处理后的DMEM培养基。通过对培养基的改良提高提取效果，更有利于脐血干细胞的生长，从而节省了人力物力财力。
[0019]进一步地，所述步骤S4中过滤器滤孔为0.22μm本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.子宫内皮修复的脐血干细胞外泌体复合制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、取样：将脐带血放入容器中进行表面消毒处理，持续进行紫外线消毒，并向容器中加入抗凝血剂和质量浓度为6％的羟乙基淀粉，混匀并去除红细胞；S2、梯度离心：将所述容器密封后倒置静置60min去上清液保留沉淀细胞，再在10
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14℃温度下、150
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200g离心力条件下离心8
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10min去上清液保留沉淀细胞，使用注射器注入含有白细胞的血浆，在室温下、180
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220g离心力条件下离心8
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10min去上清液保留沉淀细胞，注入氯化钠注射液后混匀，在200
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220g离心力条件下离心8
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10min去上清液保留沉淀细胞即为脐血干细胞；S3、培养基培养：将DMEM/F12培养基放入培养皿中，加入步骤S2得到的脐血干细胞，待脐血细胞增殖融合至80％后按照1:5的传代比进行传代，待第四代脐血细胞增殖融合至对数生长期时，去除培养基并使用磷酸盐缓冲液漂洗3次，随后加入处理后的DMEM培养基，继续培养24h，收集脐血干细胞培养基；S4、外泌体分离：预冷离心机至0
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4℃，加入步骤S3中得到的脐血干细胞培养基在300
‑
350g离心力作用下离心8
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10min，去除细胞碎片保留上清液，将上清液转移至超速离心管中并加入磷酸盐缓冲液至离心前的重量，在29500
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30000g离心力作用下离心16
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20min，去除细胞碎片保留上清液，使用过滤器过滤，再转移至另一无菌消毒超速离心管中，在120000
‑
130000g离心力作用下离心90
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100min，去上清液保留管底脐血干细胞外泌体；S5、复合制剂制备：取步骤S4中得到的脐血干细胞外泌体1
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5重量份，透明质酸2
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4重量份，苦参0.2
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0.6重量份，藏红花0.1
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0.5重量份以及椿白皮0.1
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0.3重量份，溶解于5
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7重量份的甘油溶剂中，加温至18
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24℃静置30min，再加入S4中得到的脐血干细胞外泌体1
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3重量份混匀，得到脐血干细胞外泌体复合制剂。2.根据权利要求1所述的子宫内皮修复的脐血干细胞外泌体复合制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中在放入脐带血之...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄燕，王志伟，郑旭东，
申请(专利权)人：深圳市莱利赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：