本发明专利技术涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种定量检测人脂多糖结合蛋白(LBP)的化学光试剂盒及检测方法。试剂盒包括包被人脂多糖结合蛋白抗体的孔板。检测方法包括以下步骤：(1)将待测样品加到包被有人脂多糖结合蛋白抗体的孔板中；(2)加入生物素标记的人脂多糖结合蛋白抗体；(3)孵育并洗涤干燥；(4)加入用链霉素和亲和素标记的辣根过氧化酶或链霉素和亲和素标记的碱性磷酸酶反应，洗涤干燥；(5)加入酶发光底物，读取发光值。本方法检测灵敏度更高，特异性更强；无需做血样处理，操作简便；对于所需设备也无很高要求，可实现大通量检测，成本低，可实现半自动化或全自动化批量操作，具有良好的效果和应用前景。良好的效果和应用前景。良好的效果和应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒及方法
[0001]本专利技术涉及免疫分析
，尤其涉及一种定量检测人脂多糖结合蛋白(LBP)的化学光试剂盒。
技术介绍
[0002]脂多糖结合蛋白(LBP)是一种分子量约58KDa大小的糖蛋白，其由肝细胞合成，属于脂质结合蛋白家族。其家族中还包括BPI、PLTP、CETP。LBP与革兰氏阴性菌的细胞壁成分脂多糖(LPS)的脂质A部分结合，促进LPS单体化，催化LPS单体与细胞因子CD14结合，并诱导促进LPS的免疫反应，该指标可反应机体内毒素载荷水平。
[0003]现有的检测LBP的免疫学研究解决方案，例如常规的酶联免疫分析法(ELISA法)，检测量程短，一般在0.8
‑
50ng/mL且线性不好；灵敏度不高，一般为2ng/mL左右，而且血样需要经过预先处理，经过50
‑
200倍稀释后进行检测；同时，标准差约15％，精密度不高。
[0004]此需要开发一种新的方法检测LBP，以克服上述缺陷，提高灵敏度和检测量程及精密度。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于提供一种定量检测人脂多糖结合蛋白(LBP)的试剂盒，尤其是化学发光试剂盒。本专利技术还提供了检测方法。本方法和试剂盒的检测灵敏度高、特异性好、操作简便，检测通量高，检测成本低，检测样本量少且不需要太多复杂的辅助设备和试剂。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取了下述技术方案：
[0007]一种定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒，包括包被人脂多糖结合蛋白抗体的孔板。
[0008]所述人脂多糖结合蛋白抗体为人脂多糖结合蛋白单克隆抗体或多克隆抗体。所述包被人脂多糖结合蛋白抗体的孔板，每个检测孔或检测点上包被的人脂多糖结合蛋白抗体量为0.1
‑
0.5μg，优选为0.2
‑
0.4μg。
[0009]所述包被人脂多糖结合蛋白抗体的孔板用保护蛋白封闭，所述的保护蛋白为酪蛋白、牛血清白蛋白、明胶、动物血清或人血清蛋白。
[0010]所述定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒还包括以下试剂中的至少一种：(1)生物素标记的人脂多糖结合蛋白抗体；(2)链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶或链霉亲和素标记的碱性磷酸酶；(3)辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的发光底物。
[0011]所述生物素标记的人脂多糖结合蛋白抗体人脂多糖结合蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
[0012]辣根过氧化物酶HRP的发光底物包括鲁米诺、鲁米诺衍生物和对羟基苯乙酸。碱性磷酸酶AP的发光底物包括3
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(2
‑
螺旋金刚烷
‑4‑
甲氧基
‑4‑
甲基
‑4‑
(3
‑
磷酸氧基)
‑
苯基
‑
1,2
‑
二氧乙烷(AMPPD)和4
‑
甲基伞形酮磷酸盐(4
‑
MUP，荧光底物)等。
[0013]所述定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒还包括洗涤液，所述洗涤液含有磷酸二
氢钠、氢酸氢二钠、氯化钠和吐温
‑
20；优选的，还含有防腐剂。
[0014]所述定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒还包括稀释液，用于稀释待测样品、生物素标记的人脂多糖结合蛋白抗体人脂多糖结合蛋白抗体、链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶或链霉亲和素标记的碱性磷酸酶。
[0015]所述的稀释液为pH＝7.4、0.01
‑
0.02mol/L的磷酸盐缓冲液(PB缓冲液)、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液或Tris缓冲液，且含有0.5％
‑
2％蛋白保护剂；优选的，所述蛋白保护剂为酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、明胶、动物血清、人血清、人血清蛋白；优选的，稀释液中还含有防腐剂。
[0016]优选的，所述定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒中还包含人脂多糖结合蛋白(LBP)标准品。
[0017]所述定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒的制备方法，包括将人脂多糖结合蛋白抗体包被在孔板上并用保护蛋白封闭，得到包被人脂多糖结合蛋白抗体的孔板。
[0018]所述的保护蛋白为酪蛋白、牛血清白蛋白、明胶、动物血清、人血清、人血清蛋白。
[0019]一种定量检测人脂多糖结合蛋白的方法，包括以下步骤：
[0020](1)将待测样品加到包被有人脂多糖结合蛋白抗体的孔板中；
[0021](2)加入生物素标记的人脂多糖结合蛋白抗体；
[0022](3)孵育并洗涤干燥；
[0023](4)加入用链霉素和亲和素标记的辣根过氧化酶或链霉素和亲和素标记的碱性磷酸酶反应，洗涤干燥；
[0024](5)加入酶发光底物，读取发光值。
[0025]优选的，还包括步骤(6)：与标准曲线对照，得到待测样品浓度。
[0026]步骤(1)中，所述的待测样品为血液样本，包括血清样本或血浆样本。
[0027]优选的，步骤(1)中，将待测样品稀释至20
‑
100倍，加到包被有人脂多糖结合蛋白抗体的板上。优选的，将待测样品稀释至50倍。
[0028]步骤(1)所述的孔板，每个检测孔或检测点上包被的人脂多糖结合蛋白抗体量为0.1
‑
0.5μg，优选为0.2
‑
0.4μg。
[0029]所述包被有人脂多糖结合蛋白抗体的孔板用保护蛋白封闭处理。
[0030]优选的，步骤(4)中，所述的生物素标记的人脂多糖结合蛋白抗体溶解于稀释液中，得到含有生物素标记的人脂多糖结合蛋白抗体的工作溶液，其中生物素标记的人脂多糖结合蛋白抗体含量为0.1
‑
2μg/mL，优选为0.2
‑
1μg/mL；链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶或链霉亲和素标记的碱性磷酸酶溶解于稀释液中，得到含有链霉素和亲和素标记的辣根过氧化物酶标记的工作溶液或含有链霉素和亲和素标记的碱性磷酸酶的工作溶液，以辣根过氧化酶或碱性磷酸酶计，含量为10
‑
100mIU/mL，优选为20
‑
60mIU/mL；本专利技术的一个优选方式中，含量为50mIU/mL。
[0031]所述的稀释液为pH＝7.4、0.01
‑
0.02mol/L的磷酸盐缓冲液(PB缓冲液)、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液或Tris缓冲液，且含有0.5％
‑
2％蛋白保护剂；优选的，所述蛋白保护剂为酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、明胶、动物血清、人血清、人血清蛋白；优选的，稀释液中还含有防腐剂。
[0032]优选的，步骤(5)中，所述的酶发光底物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的酶促发
光底物。辣根过氧化物酶HRP的发光底物包括鲁米诺、鲁米诺衍生物和对
‑
羟基苯乙酸。碱性磷酸酶AP的发光底物包括3
‑...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒，其特征在于，包括包被人脂多糖结合蛋白抗体的孔板。2.权利要求1所述的定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒，其特征在于，孔板每个检测孔或检测点上包被的人脂多糖结合蛋白抗体量为0.1
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0.5μg。3.权利要求1或2所述的定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒，其特征在于，人脂多糖结合蛋白抗体为人脂多糖结合蛋白单克隆抗体或多克隆抗体。4.权利要求1或2所述的定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒，其特征在于，还包括以下试剂中的至少一种：(1)生物素标记的人脂多糖结合蛋白抗体；(2)链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶或链霉亲和素标记的碱性磷酸酶；(3)辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的发光底物。5.权利要求1所述定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒的制备方法，，其特征在于，包括将人脂多糖结合蛋白抗体包被在孔板上并用保护蛋白封闭，得到包被人脂多糖结合蛋白抗体的孔板。6.一种定量检测人脂多糖结合蛋白的方法，其特征在于，包括以下...
【专利技术属性】
技术研发人员：王睿瑞，张磊，
申请(专利权)人：上海中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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