基于CRISPRCas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法、反应体系及其应用技术

本发明专利技术涉及基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法、反应体系及其应用。该反应体系用于植物转基因成分的检测，以体积份数计，每份反应体系各包括如下体积份的各成分：2份10xNE缓冲液2.1（50mM氯化钠，10mM Tris

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法、反应体系及其应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑
，具体涉及基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法、反应体系及其应用。

技术介绍

[0002]2017
‑
2019年以Cas12a(CRISPR DNA内切酶)为基础的DNA检测技术DETECTR，以Cas13a(CRISPR RNA内切酶)为基础的SHERLOCK RNA检测技术的出现，开拓了在核酸基础上利用基因编辑技术作为高通量、快速、准确、灵敏、易用检测技术的先河，基因编辑检测技术建立在高效核酸检测的基础上，与传统的单克隆抗体蛋白检测技术相比，以无可比拟的优势让多样的植物病毒和转基因植物的高效、快速监管成为可能。目前，以Cas13a为基础的体外核酸检测技术已初步在医学和植物检测上运用，显示高度敏感性、准确性；以Cas12a为基础的体外核酸检测技术已初步在医学上运用，但还没有在植物基因检测上应用；无论是CRISPR DNA内切酶还是CRISPR RNA内切酶都还没有在植物转基因成分检测上的应用报道。CRISPR DNA内切酶报告检测技术由于检测对象是DNA序列，反应体系具有更高的稳定性，在植物基因检测上更容易与传统的PCR、等温扩增等检测技术衔接起来。

技术实现思路

[0003]为充分利用CRISPR DNA内切酶检测技术的优势，填补以Cas12a为基础的体外核酸检测技术在植物基因检测上的空白，本专利技术利用Cas12a酶开展转基因植物DNA成分的检测，为转基因植物的检测提供新的技术和方法。
[0004]具体的，本专利技术提供了一种基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测反应体系，该反应体系用于植物转基因成分的检测，以体积份数计，每份反应体系各包括如下体积份的各成分：2份10xNE缓冲液2.1、1份1uM引导及折叠序列、1份1uM Lba Cas12a、1份RNA酶抑制剂、1份转基因植物DNA提取物的RPA等温扩增产物、1份反应标记物及13份水。
[0005]其中，该反应体系对应的植物转基因成分为CaMV35S启动子、HPT基因、Bar基因或NPTⅡ基因，其各自对应的引导及折叠序列如下：
[0006][0007]其中，加粗的为引导序列。
[0008]其中，该反应体系用于植物转基因成分的酶标仪检测、定量PCR仪检测以及试纸条显色检测等。
[0009]其中，酶标仪检测的反应标记物选自S2或S4，标记方法：两端分别带有FAM和BHQ1基团的含TAT碱基序列单链DNA分子，S2为5`6
‑
FAM
‑
TTAT
‑
3`BHQ1，S4为5`6
‑
FAM
‑
TAT
‑
3`BHQ1；
[0010]试纸条检测的反应标记物选自S3，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6
‑
FAM
‑
TAT
‑
Biotin
‑
3；
[0011]定量PCR仪检测的反应标记物选自S5，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6
‑
FAM
‑
TTATT
‑
3`BHQ1。
[0012]本专利技术另外提供一种基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法，包括如下步骤：
[0013]步骤S1：通过CTAB法提取植物DNA；
[0014]步骤S2：制备DNA的RPA等温扩增引物；
[0015]步骤S3：构建权利要求1
‑
3中任一项所述的反应体系；
[0016]步骤S4：通过酶标仪、定量PCR仪或试纸条显色技术等进行植物转基因成分的检测。
[0017]其中，所述步骤S2包括如下步骤：
[0018]步骤S21：以体积份数计，分别将如下体积份的各成分混合：2.2
‑
2.5份第一引物、2.2
‑
2.5份第二引物、29
‑
20份Primer Free Rehydration buffer、2份步骤S1提取的DNA、11
‑
12份水；
[0019]步骤S22：将步骤S21中各成分混匀，瞬时离心；
[0020]步骤S23：将所获取的混合液加入到TwistAmp Basic reaction，混匀；
[0021]步骤S24：加入2.5份体积份的280mM MgOAc，混匀
[0022]步骤S25：38
‑
40摄氏度下反应20分钟；
[0023]步骤S26：
‑
20摄氏度下保存备用。
[0024]酶标仪检测的反应标记物选自S2或S4，标记方法：两端分别带有FAM和BHQ1基团的含TAT碱基序列单链DNA分子，S2为5`6
‑
FAM
‑
TTAT
‑
3`BHQ1，S4为5`6
‑
FAM
‑
TAT
‑
3`BHQ1；
[0025]试纸条检测的反应标记物选自S3，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6
‑
FAM
‑
TAT
‑
Biotin
‑
3`；
[0026]定量PCR仪检测的反应标记物选自S5，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6
‑
FAM
‑
TTATT
‑
3`BHQ1。
[0027]其中，该方法用于检测植物转基因成分CaMV35S启动子、HPT基因、Bar基因或NPTⅡ基因，其各自的引物如下：
[0028]引物名称引物序列RPA
‑
35S
‑
FCCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGRPA
‑
35S
‑
RGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGRPA
‑
Bar
‑
FCTTCAAGCACGGGAACTGGCATGACGTGGGTTTCRPA
‑
Bar
‑
rGGAGAAACTCGAGTCAAATCTCGGTGACGGRPA
‑
HPT2
‑
FGTCTGCTGCTCCATACAAGCCAACCACGGRPA
‑
HPT2
‑
RCTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGRPA
‑
NPTII
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测反应体系，其特征在于：该反应体系用于植物转基因成分的检测，以体积份数计，每份反应体系各包括如下体积份的各成分：2份10xNE缓冲液2.1、1份1uM引导及折叠序列、1份1uM Lba Cas12a、1份RNA酶抑制剂、1份转基因植物DNA提取物的RPA等温扩增产物、1份反应标记物及13份水。2.如权利要求1所述的基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测反应体系，其特征在于：该反应体系对应的植物转基因成分为CaMV35S启动子、HPT基因、Bar基因或NPTⅡ基因，其各自对应的引导及折叠序列如下：引导及折叠序列名称序列LbCas12a
‑
HPT25
‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGCUCCAACAAUGUCCUGACGGA
‑
3LbCas12a
‑
HPT15
‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGCUUCGAUGUAGGAGGGCGUGG
‑
3LbCas12a
‑
Bar5
‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUggcagcUggacUUcagccUgcc
‑
3LbCas12a
‑
35s5
‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUcUUUaUcgcaaUgaUggcaUUUg
‑
3LbCas12a
‑
NPTII5
’‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCUUGGUGGUCGAAUGGGCAGGU
‑3’
其中，加粗的为引导序列。3.如权利要求1所述的基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测反应体系，其特征在于：该反应体系用于包括但不限于植物转基因成分的酶标仪检测、定量PCR仪检测以及试纸条显色检测。4.如权利要求3所述的基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测反应体系，其特征在于：酶标仪检测的反应标记物选自S2或S4，标记方法：两端分别带有FAM和BHQ1基团的含TAT碱基序列单链DNA分子，S2为5`6
‑
FAM
‑
TTAT
‑
3`BHQ1，S4为5`6
‑
FAM
‑
TAT
‑
3`BHQ1；试纸条检测的反应标记物选自S3，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6
‑
FAM
‑
TAT
‑
Biotin
‑
3`；定量PCR仪检测的反应标记物选自S5，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6
‑
FAM
‑
TTATT
‑
3`BHQ1。5.基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1：通过CTAB法提取植物DNA；步骤S2：制备DNA的RPA等温扩增引物；步骤S3：构建权利要求1
‑
3中任一项所述的反应体系；步骤S4：通过包括但不限于酶标仪、定量PCR仪或试纸条显色技术进行植物转基因成分的检测。6.如权利要求5所述的基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法，其特征在于，所述步骤S2包括如下步骤：步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵辉，杨小亮，段志强，李峰，郭安平，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：