伊短菌素高产工程菌株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程和微生物领域，具体公开了伊短菌素高产工程菌及应用。该工程菌以野生型短短芽孢杆菌为原始菌株，将启动子P

【技术实现步骤摘要】
伊短菌素高产工程菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程和微生物领域，具体涉及伊短菌素高产工程菌及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]据统计，国际上生物农药类产品己经高达100多种，其中90％以上的有效成分是芽孢杆菌或其代谢产物。芽孢杆菌制剂除了能够防治虫害，还能够抑制或杀死病原菌，保护作物免受病原菌的危害。
[0003]伊短菌素(edeines)是由短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)产生的线性非核糖体类抑菌活性物质。Edeines由四种非蛋白氨基酸残基(β
‑
Tyr/β
‑
Phe、Isoserine、DAPA和DAHAA)、一个甘氨酸和一个聚胺组成，依其序列差异，可分为edeine A、B、D和F四种组分，各组分又有α（1）和β（2）两种同分异构体，区别在于β
‑
异丝氨酸（Isoserine）中的羧基跟2,3
‑
二氨基丙酸（DAPA）中的α位氨基还是β位氨基形成肽键。伊短菌素对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性菌、支原体和真菌等微生物具有广谱抑菌活性；此外，对肿瘤细胞也有抑制效果，而且还具有免疫抑制活性。正因为如此，伊短菌素具有开发为农用或医用抗生素的良好潜力。
[0004]然而，在野生型短短芽孢杆菌中伊短菌素的产量较低，极大地阻碍了伊短菌素作为微生物源农药或生物医药的开发与应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供伊短菌素高产工程菌及其制备方法和应用，该工程菌通过对短短芽孢杆菌进行定向遗传修饰，有效提高伊短菌素的产量。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术第一方面提供一种伊短菌素高产工程菌，其是利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子P
ede
替换为P
grac
、P
spc
、P
shuttle
‑
09
和P
43
而得到的。
[0007]在具体实施方式中，所述启动子Pgrac的核苷酸序列GeneBank登录号为MH328010.1；启动子Pshuttle
‑
09的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；启动子Pspc的核苷酸序列GeneBank登录号为EU864235.1；启动子P43的核苷酸序列GeneBank登录号为DQ264732.1。
[0008]本专利技术还提供所述的伊短菌素高产工程菌的制备方法，其特征在于，将启动子P
grac
、P
spc
、P
shuttle
‑
09
或P
43
与抗性基因连接获得的融合片段，构建同源重组整合载体，利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子P
ede
替换为P
grac
、P
spc
、P
shuttle
‑
09
和P
43
得到相应的短短芽孢杆菌工程菌。
[0009]优选地，所述抗性基因是Apra
R
。更具体地，所述抗性基因Apra
R
的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0010]在一个具体实施方式中，所述同源重组整合载体以载体pE194为出发载体，与所述融合片段及野生型短短芽孢杆菌中的ede操纵子中天然启动子区的上、下游同源序列片段构建得到同源重组整合载体。
[0011]在一优选实施方式中，所述ede操纵子中天然启动子区的上游同源序列片段核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；ede操纵子中天然启动子区的下游同源序列片段核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
[0012]更进一步地，还包括对利用同源重组技术处理后的短短芽孢杆菌进行鉴定，所述鉴定的过程包括以抗性基因Apra
R
的引物为探针对其进行PCR检测，以确保原始启动子P
ede
为P
grac
、P
spc
、P
shuttle
‑
09
和P
43
所替换。
[0013]本专利技术还提供所述的伊短菌素高产工程菌在制备伊短菌素中的应用，优选地，将所述伊短菌素高产工程菌发酵，获得发酵液上清液，从中纯化伊短菌素；更优选地，是将伊短菌素高产工程菌活化后，接种于NB液体培养基中进行发酵，再将所述发酵得到的发酵液上清液进行阳离子交换树脂吸附、氨水洗脱后，经旋转蒸发后，再进行高效液相色谱分离后得到所述伊短菌素。
[0014]此外，本专利技术还提供一种菌剂，其含有所述的伊短菌素高产工程菌，其可用于抑菌，例如用于枯草芽孢杆菌的抑菌等。
[0015]通过上述技术方案，本专利技术的有益效果为：本专利技术通过构建同源重组整合载体，将野生型短短芽孢杆菌中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede强启动子P
grac
、P
spc
、P
shuttle
‑
09
和P
43
分别替换，成功构建了能够高产伊短菌素的短短芽孢杆菌工程菌；本专利技术构建的四种短短芽孢杆菌工程菌X23(P
ede
::P
grac
)、X23(P
ede
::P
spc
)、X23(P
ede
::P
sshuttle
‑
09
)和X23(P
ede
::P
43
)。发酵后伊短菌素的产量与原始菌株野生型短短芽孢杆菌X23相比分别提高了8.02倍、7.24、4.37和3.59；可见均有所提升，但用不同的启动子替换后获得的工程菌，其结果并不完全相同，以强启动子P
grac
进行替换的效果尤其显著，为实现伊短菌素在微生物源农药和医药中的开发与利用奠定了坚实的基础。
附图说明
[0016]图1是本专利技术中同源重组整合载体的构建流程图。利用Red/ET重组技术构建温度敏感的敲入载体。LLHR是线线重组的缩写。
[0017]图2是本专利技术中启动子Pgrac、P
spc
、P
shuttle
‑
09
和P
43
分别与Apra
R
的PCR扩增及重叠延伸PCR图谱。其中A1：Apra
R
‑
Pgrac融合片段PCR图、A2：抗性片段Apra片段PCR图；A3、强启动子Pgrac片段PCR图；B4：Apra
R
‑
Pshuttle
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.伊短菌素高产工程菌，其特征在于，其是利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子P
ede
替换为P
grac
、P
spc
、P
shuttle
‑
09
和P
43
而得到的。2.根据权利要求1所述的伊短菌素高产工程菌，其特征在于，所述启动子Pgrac的核苷酸序列GeneBank登录号为MH328010.1；启动子Pshuttle
‑
09的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；启动子Pspc的核苷酸序列GeneBank登录号为EU864235.1；启动子P43的核苷酸序列GeneBank登录号为DQ264732.1。3.根据权利要求1或2所述的伊短菌素高产工程菌的制备方法，其特征在于，将启动子P
grac
、P
spc
、P
shuttle
‑
09
或P
43
与抗性基因连接获得的融合片段，构建同源重组整合载体，利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子P
ede
替换为P
grac
、P
spc
、P
shuttle
‑
09
和P
43
得到相应的短短芽孢杆菌工程菌。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述抗性基因是Apra
R
。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：陈武，刘清术，黎定军，张亮，
申请(专利权)人：湖南省微生物研究院，
类型：发明
国别省市：