一种产D-阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂及其构建与应用制造技术

本发明专利技术提供了一种产D

【技术实现步骤摘要】
一种产D
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阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂及其构建与应用


[0001]本专利技术属于微生物代谢工程领域，具体涉及一种产D
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阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂及其构建与应用。

技术介绍

[0002]随着人们生活水平大幅度提高，低热量饮食逐渐成为一种潮流，阿斯巴甜、木糖醇和三氯蔗糖等化学品随之出现。稀有糖中D
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阿洛酮糖（D
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psicose）也属低热量的代表之一，它是D
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果糖的C3差向异构体，其甜度为蔗糖的70%，但热量仅为等量蔗糖的0.3%。据科学研究证实，D
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阿洛酮糖在预防肥胖、调节血糖、降血脂以及抗氧化等方面更具有独特的生理学功能，未来它将在食品、饮料、保健、医药等领域拥有巨大的市场前景。
[0003]D
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阿洛酮糖的制备方法包括化学合成法和生物合成法。前者普遍存在副产物多、分离步骤复杂、废弃物难处理等问题，导致了极高的生产成本，实现工业化生产困难。而生物合成法所需的反应条件温和，且具有特异性高、绿色环保等优势，对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产D
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阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂，其特征在于：所述重组菌单细胞工厂是利用重组载体在大肠杆菌JM109(DE3)中过表达D
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶基因dpe催化D
‑
果糖转化为D
‑
阿洛酮糖，再敲除果糖特异性PTS转移蛋白基因fruA、甘露糖特异性PTS转移蛋白基因manXYZ和果糖激酶基因mak共三个基因，从而减少果糖在细胞体内磷酸化后造成的浪费，同时过表达Sec蛋白转位通道的三个亚基基因secY(ΔP)、secE、secG以及外膜致孔蛋白基因sCVE共四个基因，构建大肠杆菌转运果糖的非磷酸化通道来加快底物进入细胞，并在此基础上敲除UDP
‑
半乳糖4
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差向异构酶基因galE和1
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磷酸果糖激酶基因fruK共两个基因，利用Ni
2+
下调FbaA蛋白的功能性，控制碳代谢通量得到的。2.如权利要求1所述的产D
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阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）在大肠杆菌JM109(DE3)中构建并表达将D
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果糖转化为D
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阿洛酮糖的基因dpe，得到菌株E.coli (DPE);（2）在菌株E.coli (DPE)中敲除导致果糖磷酸化的基因fruA，manXYZ和mak，得到菌株E.coli (DPE, ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)；（3） 在菌株E.coli (DPE, ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)中构建并表达大肠杆菌转运果糖的非磷酸化通道的基因secY(ΔP)、secE、secG和sCVE，得到菌株E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)；（4）在菌株E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)中敲除副产物代谢途径及果糖代谢途径的基因galE和fruK，，得到重组菌株E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak, ΔGalE, ΔFruK)，同时通过Ni
2+
抑制剂，抑制FbaA活性，关闭果糖代谢总开关。3.根据权利要求2所述的重组菌单细胞工厂的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）具体过程如下：使用dpe
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F和dpe
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R一对引物对人工合成的dpe基因模板进行PCR扩增反应，利用BamH I和Hind III两个酶切位点将dpe基因插入pRSFDuet
‑
1，得到pRSFDuet
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dpe重组载体，借助电化学转化法将重组载体转染进大肠杆菌JM109(DE3)中进行表达；所述dpe基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述引物dpe
‑
F和dpe
‑
R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求2所述的重组菌单细胞工厂的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）具体过程如下：依次使用fruA
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F/fruA
‑
R，manXYZ
‑
F/manXYZ
ꢀ‑
R和mak
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F/mak
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R三对含有同源臂的引物序列以pkD13为模板进行PCR扩增，将得到的片段转染进含有pkD46的大肠杆菌JM109(DE3)中，在30℃的条件下进行同源重组，再利用pcp20质粒完成抗性消除，最后在...

【专利技术属性】
技术研发人员：范立海，郭强，郑辉东，郑灵洁，
申请(专利权)人：清源创新实验室，
类型：发明
国别省市：