一种检测衣原体的多肽探针及其应用制造技术

本发明专利技术属于医药生物技术和医学检验技术领域，具体涉及一种检测衣原体的多肽探针及其应用。本发明专利技术所述多肽探针是一段肽链Ac

【技术实现步骤摘要】
一种检测衣原体的多肽探针及其应用


[0001]本专利技术属于医药生物技术和医学检验
，具体涉及一种检测衣原体的多肽探针及其应用。

技术介绍

[0002]衣原体科衣原体属(Chlamydia spp.)微生物包括感染人的沙眼衣原体(C.trachomatis)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)，猪衣原体(C.suis)、鼠衣原体(C.muriradum)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)、猫衣原体(C.felis)、豚鼠衣原体(C.caviae)、流产的流产嗜性衣原体(C.abortus)、反刍动物衣原体(C.pecorum)等，其中很多是人或动物感染的重要病原体。沙眼衣原体感染不但可以引起沙眼，甚至致盲，沙眼衣原体泌尿生殖道感染是最为常见的性传播疾病病，引起尿道炎，女性盆腔炎、输卵管损伤，导致宫外孕甚至不孕。根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)估计，全球每年有近亿人新的CT感染病例发生，同时在发展中国家发生率也呈逐年上升趋势。此外，性传播沙眼衣原体还可以增加人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的机率。流产嗜性衣原体及鹦鹉热衣原体是引起猪、牛、羊等多种动物流产、死胎、弱胎等慢性接触性疾病的一种重要病原体,孕妇也可感染而发生流产，给我国养殖业带来巨大的经济损失；而鹦鹉热衣原体还是人兽共患病重要病原体，有可能为恐怖分子用于生物武器。因此，建立快速、准确的诊断方法是预防和控制衣原体感染的重要措施，对人民健康和农业发展具有重要意义。
[0003]目前，针对衣原体感染有一系列常见传统的检测方法，如细胞培养法、直接免疫荧光法、聚合酶链反应法、酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法等。但是目前临床上各种沙眼衣原体的检测手段仍然存在不同程度的缺陷，特别是对于临床弱阳性的样本无法得到十分准确可靠的检测结果。因此摸索并建立一种特异性强、简便快速的沙眼衣原体检测技术，对于沙眼衣原体诊断和预防具有重要的意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术需要解决的问题是提供一种检测衣原体的多肽探针及其应用。本专利技术将一段肽链与特定化合物偶联制作底物，当含衣原体的裂解液或衣原体蛋白酶作用于该底物时，由于酶切割释放该特定化合物产生具有包括颜色改变、产生经激发产生荧光的化合物、或者荧光素酶底物。利用比色、荧光强度、荧光成像或者测定生物素荧光强度的变化，实现不同显色信号的差异，作为检测衣原体的指标。案例说明该测定方法选用的肽链片段特异性强，可用于实时检测衣原体的质控物，在相关领域有较好的适用性。
[0005]衣原体属微生物属于革兰氏阴性病原体，是一类严格胞内原核微生物，采取寄生的方式在真核细胞内利用二分裂方式增殖。在感染复制过程中，衣原体与宿主细胞交换小分子物质，同时衣原体可能利用物质释放抑制宿主细胞抗微生物免疫应答。基因序列分析显示，引起人类疾病的衣原体很多主要基因及蛋白序列高度同源，比如鹦鹉热衣原体与嗜肺炎衣原体外膜主蛋白基因的同源性为71％，与沙眼衣原体之间为68％。以沙眼衣原体D型
序列为参考，对其基因组序列分析，发现基因组编码16个蛋白酶，其中以丝氨酸蛋白酶以及天门冬氨酸蛋白酶为主，但是这些酶在感染过程中的作用缺乏了解，也缺少实时监控蛋白酶释放的探针及物质。因此专利技术一种检测衣原体的质控物，为提高衣原体检测研究技术，开发相关产品，探索衣原体诊断和治疗新方法提供了更为可靠的实验评估工具，包括开发人及牛羊衣原体相关预防、诊断、评分等技术有着十分广泛的应用；在基础医学研究应用方面，可以利用该方法进行沙眼衣原体感染活细胞成像检测以及相关盆腔炎、不孕不育等机制的实验性探索，对沙眼衣原体的潜在药物和技术进行效果评估。
[0006]本专利技术所建立的检测衣原体的方法在研究其感染过程、治疗药物靶标研究方面可提供客观有效的实验数据级评估，具有应用价值。
[0007]本专利技术的技术方案：
[0008]检测沙眼衣原体质控物的构建：
[0009]衣原体蛋白酶特定切割底物的确定：
[0010]文献报道衣原体蛋白酶可以切割不同宿主蛋白，比如CT441以及同属衣原体对应的同源蛋白酶都可以特异切割p65蛋白底物。基于此信息，本专利技术设计了一个由4个氨基酸组成的探针，其特点是其N末端进行乙酰化处理，C末端氨基酸为丝氨酸并与pNA偶联，探针基本形式为Ac
‑
Lys Asn Ser Ser
‑
pNA。这里Lys Asn Ser Ser为必须序列，C末端为丝氨酸(Ser，S)残基，Ac修饰的N末端可以延伸，延伸序列不影响该探针功能；C末端后续基团可以是但不局限于pNA，AMC，Luc等用于比色、荧光以及生物素酶活性检测的标记物等。
[0011]本专利技术所述检测衣原体的多肽探针是将一段肽链Ac
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Lys Asn Ser Ser
‑
x，Ac代表N末端乙酰化，x代表C末端偶联的用比色分析的对硝基苯胺pNA或荧光化合物7
‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素AMC或生物素荧光素酶底物生物素Luc化合物；
[0012]反应及检测通式如下：
[0013][0014][0015][0016]这里，pNA是对硝基苯胺，当多肽底物被衣原体蛋白酶切割后，pNA作为游离基团被释放，在405nm测定游离pNA，检测衣原体的感染情况。
[0017]这里，AMC是7
‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素，是一种荧光染料，与多肽序列结合时无法产生荧光，当该底物水解后AMC被释放，游离的7
‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素即可产生荧光(ex/em:380nm/460nm)，根据激发的荧光强度可以检测衣原体感染情况。
[0018]以Ac
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Lys Asn Ser Ser为基序，C末端偶联AMC制备荧光探针，将不同剂量的探针加在感染或未感染的细胞上，37℃孵育10分钟，在荧光光度计上测定荧光强度，检验探针裂解情况，与加入的衣原体关联，得出感染剂量曲线；结合荧光显微镜技术，该探针还可以用于衣原体感染过程中蛋白酶在细胞中的定位，蛋白酶的释放以及影响蛋白酶释放的外界刺激因素等。
[0019]这里，Luc指不同来源的荧光素(luciferin)，与多肽序列结合时无法被荧光素酶
利用发光，当该底物水解后释放Luc，游离的Luc在合适条件下是荧光素酶底物，可以通过检测光强度测定。
[0020]以Ac
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Lys Asn Ser Ser为基序，C末端偶联荧光素探针(Ac
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Lys Asn Ser Ser
‑
Luc)，当酶解释放Luc后可以作为荧光素酶的底物，用于定量检测衣原体酶活性和感染情况。
[0021]本专利技术所提供的检测沙眼衣原体的质控物，其特点是：鉴定出一段沙眼衣原体蛋白酶特异性切割的序列，将其基团结合形成稳定底物，利用该肽链被衣原体蛋白酶特异性切割的特点，建立检测沙眼衣原体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测衣原体的含多肽的探针，其特征是将一段肽链Ac
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Lys Asn Ser Ser
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x，Ac代表N末端乙酰化，x代表C末端偶联的用比色分析的对硝基苯胺pNA或荧光化合物7
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氨基
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甲基香豆素AMC或生物素...

【专利技术属性】
技术研发人员：何素素，徐冬格，李猛，李晶晶，李尔广，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：