可用于离子交换色谱和质谱分析的方法、组合物和试剂盒技术

本公开涉及可用于多种分析物的增强pH梯度阳离子交换色谱的方法、组合物和试剂盒。在各个方面，本公开涉及色谱洗脱试剂盒，该色谱洗脱试剂盒包括(a)具有第一pH并包含第一浓度的第一有机酸盐的第一水性缓冲溶液和(b)具有第二pH并包含第二浓度的第一有机酸盐的第二水性缓冲溶液，其中第一有机酸盐包括第一有机酸铵盐，其中第二pH大于第一pH，并且其中第二浓度大于第一浓度。在各个方面，本公开涉及在色谱分离中使用此类水性缓冲溶液的方法。色谱分离中使用此类水性缓冲溶液的方法。色谱分离中使用此类水性缓冲溶液的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】可用于离子交换色谱和质谱分析的方法、组合物和试剂盒
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年3月8日提交的美国临时专利申请号62/815,514的权益和优先权，其全部内容以引用方式并入。


[0003]本公开涉及可用于多种分析物的增强梯度离子交换色谱的方法、组合物和试剂盒。

技术介绍

[0004]离子交换色谱(IEX)已广泛应用于蛋白质的分离和分析。在IEX中，基于蛋白质与固定相上存在的带相反电荷的部分的离子相互作用来分离蛋白质。在其中pH低于等电点(pI)的条件下，蛋白质带正电。随着流动相pH增加，蛋白质逐渐失去正电荷并变为中性，然后带负电。在阳离子交换色谱中，带正电的蛋白质吸附到带负电的固定相中。可通过盐或pH梯度机制使这些蛋白质洗脱。在盐梯度分离中，具有更多电荷的蛋白质需要更高浓度的盐，而在pH梯度技术中，具有不同pI的蛋白质可通过流动相pH的变化来分离。
[0005]在实施过程中，1EX用于分析许多不同类型的生物分子和许多不同类型的蛋白质。可从这些分离中收集大量信息，特别是当将它们应用于蛋白质治疗剂的分析时。作为一种类型的蛋白质治疗剂，单克隆抗体(mAb)已用于治疗许多疾病。作为生产的内在结果，需要仔细表征蛋白质治疗剂的翻译后修饰(PTM)，因为微小的结构差异可对药物稳定性、效力和功效具有显著影响。一些修饰，诸如脱酰胺化、唾液酸化、C
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末端赖氨酸变异等，引起蛋白质净电荷的改变。IEX是检测和监测这些独特蛋白质变体的形成的有价值的手段。
>[0006]然而，由于在盐梯度方法和pH梯度方法两者中普遍使用高离子强度的非挥发性缓冲液，详细分析的大多数示例依赖于耗时的离线级分收集或麻烦的多维LC质谱(MS)。更理想的是，期望实现基于有利于与质谱直接耦合的挥发性流动相组合物的优化、稳固的IEX分离。迄今为止，已公布了两种示例性IEX
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MS分析。Leblanc和同事开发了一种用于利用中间朝上方法对mAb进行电荷变体表征的双盐/pH梯度方法。Leblanc，Y.；Ramon，C.；Bihoreau，N.；Chevreux，G.，“通过与天然质谱在线联接的离子交换色谱对单克隆抗体的电荷变体进行表征：在+5℃下长期储存后的案例研究(Charge variants characterization of a monoclonal antibody by ion exchange chromatography coupled on
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line to naive mass spectrometry：Case study after a long
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term storage at+5degrees C)”，Journal of chromatography.B，Analytical technologies in the biomedical and life sciences 2017，1048，130
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139。在该工作中，使用挥发性盐甲酸铵和乙酸铵在3.9至7.4的pH范围内，在天然条件下用IEX
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MS直接分析mAb的IdeS消化亚基。在实践中，已经证明用该技术获得的MS的色谱分辨率和质量是不理想的，并且流动相组成由于具有比所需更多的组分而不必要地复杂化，因为其继续甲酸铵和乙酸铵两者。最终，盐加合物的丰度损害了来自该方法的质谱的可判读性，并且其取决于高盐浓度。最近，F
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ssl和同事开发了基于碳
酸氢铵、乙酸和氢氧化铵的pH梯度方法。Fussl，F.；Cook，K.；Scheffler，K.；Farrell，A.；Mittermayr，S.；Bones，J.，“使用直接联接pH梯度阳离子交换色谱进行高分辨率天然质谱的单克隆抗体的电荷变体分析(Charge VariantAnalysis of Monoclonal Amibodies Using Direct Coupled pH Gradient Cation Exchange Chromatography to High
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Resolution Native Mass Spectrometry.)”Analytical Chemistry 2018，90(7)，4669
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4676。该流动相体系在5.3至10.18的pH范围内提供相对恒定的电导率，以分析具有不同pI的完整mAb。然而，针对每种分析物需要对梯度进行微调，并且由于流动相包含碳酸氢铵，在所得MS谱中容易观察到二氧化碳加合物。

技术实现思路

[0007]本公开提供了促进分析物的梯度离子交换色谱的新型方法、流动相组合物和试剂盒。本公开的方法、流动相组合物和试剂盒是有利的，因为它们与分析物的MS检测相容。
[0008]在各个方面，本公开涉及色谱洗脱试剂盒，该色谱洗脱试剂盒包括(a)具有第一pH并包含第一浓度的第一有机酸盐的第一水性缓冲溶液和(b)具有第二pH并包含第二浓度的第一有机酸盐的第二水性缓冲溶液，其中第一有机酸盐包括第一有机酸铵盐，其中第二pH大于第一pH，并且其中第二浓度大于第一浓度。
[0009]在可结合上述方面中的任一个使用的一些实施方案中，第一水性缓冲溶液和第二水性缓冲溶液中的每一种包含小于20％、小于10％、小于5％、或小于1％的不同于第一有机酸铵盐的第二有机酸铵盐。
[0010]在可结合上述方面中的任一方面使用的一些实施方案中，第一有机酸盐基本上由第一有机酸铵盐组成。
[0011]在可结合上述方面中的任一个使用的一些实施方案中，第一有机酸铵盐是第一水性缓冲溶液和第二水性缓冲溶液中的每一者中的唯一有机酸铵盐。
[0012]在可结合上述方面和实施方案中的任一者使用的一些实施方案中，第一水性缓冲溶液和第二水性缓冲溶液中的每一者不包含碳酸氢铵。
[0013]在可结合上述方面和实施方案中的任一者使用的一些实施方案中，第一水性缓冲溶液和第二水性缓冲溶液各自具有小于100ppb、有利地小于20ppb的钠和钾浓度。
[0014]在可结合上述方面和实施方案中的任一者使用的一些实施方案中，第一水性缓冲溶液具有介于4和6之间，更有利地介于4.5和5.5之间的pH，以及介于20mM和120mM之间，更有利地介于40mM和100mM之间的浓度。
[0015]在可结合上述方面和实施方案中的任一者使用的一些实施方案中，第二水性缓冲溶液具有介于7.5和9.0之间，更有利地介于8和8.5之间的pH，以及介于100mM和300mM之间，更有利地介于120mM和200mM之间的浓度。
[0016]在可结合上述方面和实施方案中的任一者使用的一些实施方案中，第一水性缓冲溶液具有0.1毫西门子(mS)至10mS范围内的电导率，并且第二水性缓冲溶液具有3mS至100mS范围内的电导率。
[0017]在可结合上述方面和实施方案中的任一者使用的一些实施方案中，pH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种色谱洗脱试剂盒，包括(a)具有第一pH并包含第一浓度的第一有机酸盐的第一水性缓冲溶液和(b)具有第二pH并包含第二浓度的第一有机酸盐的第二水性缓冲溶液，其中所述第一有机酸盐包括第一有机酸铵盐，其中所述第二pH大于所述第一pH，并且其中所述第二浓度大于所述第一浓度。2.根据权利要求1所述的色谱洗脱试剂盒，其中所述第一水性缓冲溶液和所述第二水性缓冲溶液中的每一者包含至多20％的不同于所述第一有机酸铵盐的第二有机酸铵盐。3.根据权利要求1所述的色谱洗脱试剂盒，其中所述第一有机酸盐基本上由所述第一有机酸铵盐组成。4.根据权利要求1所述的色谱洗脱试剂盒，其中所述第一有机酸铵盐是所述第一水性缓冲溶液和所述第二水性缓冲溶液中的每一者中的唯一有机酸铵盐。5.根据权利要求1至4中任一项所述的色谱洗脱试剂盒，其中所述第一水性缓冲溶液和所述第二水性缓冲溶液各自具有小于100ppb的钠和钾的浓度。6.根据权利要求1至5中任一项所述的色谱洗脱试剂盒，其中所述第一水性缓冲溶液具有介于4和6之间的pH以及介于20mM和120mM之间的所述第一有机酸铵盐的浓度，其中所述第二水性缓冲溶液具有介于7.5和9.0之间的pH以及介于100mM和300mM之间的所述第一有机酸铵盐的浓度。7.根据权利要求1至5中任一项所述的色谱洗脱试剂盒，其中所述第一水性缓冲溶液具有介于4和6之间的pH以及介于30mM至100mM之间的所述第一有机酸铵盐的浓度，并且其中所述第二水性缓冲溶液具有介于7.5和9.0之间的pH以及介于100mM至200mM之间的所述第一有机酸铵盐的浓度。8.根据权利要求1至7中任一项所述的色谱洗脱试剂盒，其中所述第一水性缓冲溶液具有0.1毫西门子(mS)至10mS范围内的电导率，并且其中所述第二水性缓冲溶液具有3mS至100mS范围内的电导率。9.根据权利要求1至8中任一项所述的色谱洗脱试剂盒，其中pH对所述第一水性缓冲溶液相对于所述第一水性缓冲溶液和所述第二水性缓冲溶液的二元混合物的总体积的体积百分比的曲线图是线性的。10.根据权利要求1至9中任一项所述的色谱洗脱试剂盒，其中电导率对所述第一水性缓冲溶液相对于所述第一水性缓冲溶液和所述第二水性缓冲溶液的二元混合物的总体积的体积百分比的曲线图是线性的。11.根据权利要求1至10中任一项所述的色谱洗脱试剂盒，其中电导率对所述第一水性缓冲溶液相对于所述第一水性缓冲溶液和所述第二水性缓冲溶液的二元混合物的总体积的体积百分比的曲线图不表现出负斜率。12.根据权利要求1至5中任一项所述的色谱洗脱试剂盒，还包括用于稀释所述第一水性缓冲溶液和所述第二水性缓冲溶液中的每一者的说明书，当遵循所述说明书时得到pH介于4和6之间且所述第一有机酸铵盐的浓度介于20mM和120mM之间的稀释的第一水性缓冲溶液和pH介于7.5和9.0之间且所述第一有机酸铵盐的浓度介于100mM和300mM之间的稀释的第二水性缓冲溶液。13.根据权利要求12所述的色谱洗脱试剂盒，其中当遵循所述用于稀释所述第一水性缓冲溶液和所述第二水性缓冲溶液中的每一者的说明书时，得到pH介于4.5和5.5之间且所
述第一有机酸铵盐的浓度介于40mM和100mM之间的稀释的第一水性缓冲溶液和pH介于8.0和8.5之间且所述第一有机酸铵盐的浓度介于120mM和200mM之间的稀释的第二水性缓冲溶液。14.根据权利要求12至13中任一项所述的色谱洗脱试剂盒，其中所述稀释的第一水性缓冲溶液具有0.1mS至10mS范围内的电导率，并且其中所述稀释的第二水性缓冲溶液具有3mS至100mS范围内的电导率。15.根据权利要求12至14中任一项所述的色谱洗脱试剂盒，其中pH对所述稀释的第一水性缓冲溶液相对于所述稀释的第一水性缓冲溶液和所述稀释的第二水性缓冲溶液的二元混合物的总体积的体积百分比的曲线图是线性的。16.根据权利要求12至15中任一项所述的色谱洗脱试剂盒，其中电导率对所述稀释的第一水性缓冲溶液相对于所述稀释的第一水性缓冲溶液和所述稀释的第二水性缓冲溶液的二元混合物的总体积的体积百分比的曲线图是线性的。17.根据权利要求12至16中任一项所述的色谱洗脱试剂盒，其中电导率对所述稀释的第一水性缓冲溶液相对于所述稀释的第一水性缓冲溶液和所述稀释的第二水性缓冲溶液的二元混合物的总体积的体积百分比的曲线图不表现出负斜率。18.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：王琦，M，
申请(专利权)人：沃特世科技公司，
类型：发明
国别省市：