本发明专利技术提供了基于CRISPR技术进行多重核酸检测的方法，具体地提供了一种基于CRISPR技术检测靶核酸的方法、系统和试剂盒，所述的检测方法包括向含有靶核酸的反应体系中加入第一核酸检测组合物、第二核酸检测组合物、第三核酸检测组合物和第四核酸检测组合物中的任意一种、任意两种、任意三种或四种，以实现对于靶核酸的多重检测。靶核酸的多重检测。
【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR技术进行多重核酸检测的方法
[0001]本申请是申请日为2021年3月3日、申请号为202110236947.2、专利技术名称为“基于CRISPR技术进行多重核酸检测的方法”的专利技术专利申请的分案申请。
[0002]本专利技术涉及核酸检测领域，涉及基于CRISPR技术进行多重核酸检测的方法，具体涉及基于CRISPR技术进行靶核酸检测的方法、系统和试剂盒，尤其涉及一种基于CRISPR技术进行多重靶核酸检测的方法。
技术介绍
[0003]特异性检测核酸分子(Nucleic acid detection)方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断(NADs,nucleic acid diagnostics)，在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要义。另一个方面是对人或其他物种的单核苷酸多态性(SNPs,single nucleotide polymorphisms)的检测。在基因组水平上去理解遗传变异和生物学功能之间的关系为现代分子生物学提供了新视角，而其中SNPs对生物学的功能、进化和疾病等密切相关，因此SNPs的检测与分析技术的发展尤为重要。
[0004]目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。现有检测技术包括限制性核酸内切酶方法、Southern、Northern、斑点杂交、荧光PCR检测技术、LAMP环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等方法。2012年之后，CRISPR基因编辑技术兴起，张锋团队基于RPA技术开发了一种以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术(SHERLOCK技术)，Doudna团队开发了一种以Cas12酶为核心的诊断技术(DETECTR技术),中国科学院上海植物生理生态研究所王金博士等也开发了一种基于Cas12的新型核酸检测技术(HOLMES技术)。基于CRISPR技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。
[0005]尽管现有核酸检测技术众多，如何更加快速、简便、廉价、精确的检测仍然是改进检测技术的重要方向，尤其是如何对核酸进行多重检测，是亟待解决的问题。
技术实现思路
[0006]本专利技术提供了一种基于CRISPR技术进行核酸检测的方法，尤其是对核酸进行多重检测的方法、系统和试剂盒。
[0007]一方面，本专利技术提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与核酸检测组合物接触，所述核酸检测组合物包括Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器；所述gRNA包括与所述Cas蛋白结合的区域和与靶核酸上的靶序列杂交的导向序列；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；
[0008]所述核酸检测组合物选自第一核酸检测组合物、第二核酸检测组合物、第三核酸
检测组合物和第四核酸检测组合物中的任意一种、任意两种、任意三种或四种；
[0009]所述第一核酸检测组合物包括Cas12i，可以结合Cas12i以及与靶核酸上的第一靶序列杂交的第一gRNA，和第一单链核酸检测器；
[0010]所述第二核酸检测组合物包括Cas12b，可以结合Cas12b以及与靶核酸上的第二靶序列杂交的第二gRNA，和第二单链核酸检测器；
[0011]所述第三核酸检测组合物包括Cas12a，可以结合Cas12a以及与靶核酸上的第三靶序列杂交的第三gRNA，和第三单链核酸检测器；
[0012]所述第四核酸检测组合物包括Cas12j，可以结合Cas12j以及与靶核酸上的第四靶序列杂交的第四gRNA，和第四单链核酸检测器。
[0013]所述第一单链核酸检测器含有至少两个连续的核苷酸，所述核苷酸为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核酸类似物中的一种或几种；所述核糖核苷酸的碱基选自A、U、C、G、T、I中的一种或任意几种；所述脱氧核糖核苷酸的碱基选自A、T、C、G、U、I中的一种或任意几种。
[0014]优选的，所述第一单链核酸检测器的核酸为两个连续的核苷酸，所述核苷酸为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核酸类似物中的一种或几种。
[0015]所述核酸类似物包括2
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氟基修饰、2
’
氧甲基修饰、锁核酸、桥核酸、吗啉核酸、乙二醇核酸、己糖醇核酸、苏糖核酸、阿拉伯糖核酸、2
’
甲氧基乙酰基修饰、2
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氨基修饰、4
’‑
硫RNA及其组合；优选的，所述核酸类似物为2
’‑
氟基修饰的核酸类似物。
[0016]进一步的，所述核糖核苷酸的碱基选自A、U、C、G、T、I中的一种或任意几种；所述脱氧核糖核苷酸的碱基选自A、T、C、G、U、I中的一个或任意几种。所述核酸类似物的碱基选自A、U、C、G、T、I中的一种或任意几种；优选的，所述核酸类似物的碱基选自T和/或C。
[0017]优选的，所述第一单链核酸检测器的核酸为两个连续的脱氧核苷酸，所述脱氧核糖核苷酸的碱基序列为TT或CT。
[0018]优选的，所述第一单链核酸检测器为两个连续的核酸类似物。
[0019]更优选的，所述第一单链核酸检测器为两个连续的2
’‑
氟基修饰的核酸类似物。
[0020]进一步的，所述第一单链核酸检测器为两个连续的2
’‑
氟基修饰的T，或者是，2
’‑
氟基修饰的T和2
’‑
氟基修饰的C组成的单链。
[0021]所述第二单链核酸检测器选自含有无碱基间隔物的单链核酸检测器；或者，所述第二单链核酸检测器的核酸结构为核酸类似物，所述核酸类似物为锁核酸(LNA)，包含锁核酸的单链核酸检测器还记载在了中国申请CN2020105609327中。所述锁核酸的碱基选自A、T、C、G、U、I中的一种或任意几种。
[0022]所述含有无碱基间隔物的单链核酸检测器含有至少1个任意的核苷酸和至少1个无碱基间隔物；优选的，所述核苷酸的两端分别连接有至少1个无碱基间隔物；更优选的，所述核苷酸的两端分别连接有至少2个无碱基间隔物；在优选的实施方式中，所述单链核酸检测器仅含有1个任意的核苷酸。
[0023]在一个实施方式中，所述含有无碱基间隔物的单链核酸检测器包括至少2个不连续的任意的核苷酸，所述不连续的任意的核苷酸之间连接至少1个无碱基间隔物；在一个实施方式中，所述不连续的任意的核苷酸之间连接2
‑
20个无碱基间隔物；优选，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或20个无碱基间隔物。
[0024]在一个实施方式中，所述核苷酸的两端分别连接有2
‑
20个无碱基间隔物；优选，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或20个无碱基间隔物。
[0025本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种非疾病诊断目的的检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与核酸检测组合物接触，所述核酸检测组合物包括Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器；所述gRNA包括与所述Cas蛋白结合的区域和与靶核酸上的靶序列杂交的导向序列；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；所述核酸检测组合物为第三核酸检测组合物；所述第三核酸检测组合物包括Cas12a，可以结合Cas12a以及与靶核酸上的第三靶序列杂交的第三gRNA，和第三单链核酸检测器；所述第三单链核酸检测器是含有无碱基间隔物的单链核酸检测器，所述含有无碱基间隔物的单链核酸检测器含有1个任意的核苷酸和至少1个无碱基间隔物，所述核苷酸的两端分别连接有至少1个无碱基间隔物。2.一种非疾病诊断目的的对样品中的靶核酸进行双重检测的方法，所述方法包括将样品与核酸检测组合物接触，所述核酸检测组合物包括Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器；所述gRNA包括与所述Cas蛋白结合的区域和与靶核酸上的靶序列杂交的导向序列；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；所述核酸检测组合物包括第三核酸检测组合物；所述第三核酸检测组合物包括Cas12a，可以结合Cas12a以及与靶核酸上的第三靶序列杂交的第三gRNA，和第三单链核酸检测器；所述第三单链核酸检测器是含有无碱基间隔物的单链核酸检测器，所述含有无碱基间隔物的单链核酸检测器含有1个核苷酸和至少1个无碱基间隔物，所述核苷酸的两端分别连接有至少1个无碱基间隔物，所述第三单链核酸检测器的核酸的碱基为A、G或C；所述核酸检测组合物还包括第四核酸检测组合物；所述第四核酸检测组合物包括Cas12j，可以结合Cas12j以及与靶核酸上的第四靶序列杂交的第四gRNA，和第四单链核酸检测器；所述第四单链核酸检测器的核酸结构为核酸类似物，所述核酸类似物为2
’
氧甲基RNA。3.根据权利要求1
‑
2任一所述的方法，其特征在于，所述可检测信号通过以下方式进行检测：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。4.根据权利要求1
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2任一所述的方法，其特征在于，所述靶核酸包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述靶核酸包括单链核酸、双链核酸。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述靶核酸包括单链DNA、双链DNA。7.根据权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：梁亚峰，孙洁，刘锐恒，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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