一种同位素稀释质谱法定量检测游离DNA含量的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，尤其涉及一种同位素稀释质谱法定量检测游离DNA含量的方法。首先公开了一种肽核酸探针，所述肽核酸探针中的核酸部分序列如SEQ ID NO：1所示，所述肽核酸探针中的肽部分序列如SEQ ID NO：2所示。还公开了一种同位素稀释质谱法定量检测游离DNA单链含量的方法包括：形成游离DNA

【技术实现步骤摘要】
一种同位素稀释质谱法定量检测游离DNA含量的方法


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种同位素稀释质谱法定量检测游离DNA含量的方法。
[0002]
技术介绍

[0003]目前，游离DNA单链定量检测方法主要包括聚合酶链反应法（PCR法）、分子杂交法、基因芯片法、DNA结合蛋白法等，其中使用最为广泛的为PCR法。但PCR法首先需要对游离DNA单链进行扩增，然后进行凝胶成像，需要耗费大量的时间和人力成本，结果易受各种因素的影响，而且不能绝对定量。
[0004]同位素稀释质谱法是一种新的游离DNA单链直接定量检测法，是目前公认的化合物准确定量的权威方法。该法利用质谱测定加入了同位素标记的待测物样品中标记与非标记待测物峰面积比值来间接计算待测物在样品中浓度，并根据生物素化效率、SPE回收率和酶解效率修正DNA定量结果，使检测结果准确可靠。该法相对于其他的测定方法具有特异性高、灵敏度高、定量结果准确可靠等优点。然而现有技术中的同位素稀释质谱法还存在分析速度和分析通量不高等问题，准备性也还有待提高。
[0005]
技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是提供一种安全可靠的游离DNA单链含量测定的方法，本专利技术方法可以对血清样品中游离DNA单链含量直接进行测定。
[0007]具体的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术第一个方面公开了一种肽核酸探针，其中，所述肽核酸探针中的核酸部分序列如SEQ ID NO：1所示，所述肽核酸探针中的肽部分序列如SEQ ID NO：2所示；优选的，通过聚乙二醇连接所述核酸部分和肽部分得到肽核酸探针。
[0008]应当理解，与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2序列具有90%以上（例如92%、95%和98%等）同源性，且功能相同的序列均在本专利技术的保护范围之内。
[0009]本专利技术第二个方面公开了上述的肽核酸探针在同位素稀释质谱法定量检测游离DNA单链含量方法中的应用。
[0010]本专利技术第三个方面公开了一种同位素稀释质谱法定量检测游离DNA单链含量的方法，包括：S1：将合成的肽核酸探针配成溶液后，将合成的同位素标记多肽配成溶液作为内标；S2：将生物素化的游离DNA单链与链霉亲和素磁珠反应，形成游离DNA
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生物素
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链霉亲和素磁珠复合物；S3：加入肽核酸探针捕获所述游离DNA
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生物素
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链霉亲和素磁珠复合物，然后对所
述游离DNA
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生物素
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链霉亲和素磁珠复合物进行酶解，将酶解产物固相萃取后复溶，定量检测；S4：以不同浓度DNA标准品为横坐标，以肽核酸酶解肽段与同位素标记酶解肽段峰面积比为纵坐标建立标准曲线，根据二者峰面积比间接计算样本中DNA含量；S5：修正DNA浓度得到最终浓度值。
[0011]应当理解，本专利技术中的方法并不限于上述步骤，在S1之前、S1与S2之间、S2与S3之间，S3与S4之间、S4与S5之间、S5之后，本领域技术人员可以根据需要，增加其他额外的步骤，且均在本专利技术的保护范围之内。
[0012]优选的，所述步骤S1之前还包括步骤S0：将合成的游离DNA单链配成系列浓度标准溶液，用于建立标准曲线。
[0013]优选的，在S1中，所述肽核酸探针中的核酸部分序列如SEQ ID NO：1所示，所述肽核酸探针中的肽部分和所述多肽的序列如SEQ ID NO：2所示。
[0014]优选的，在S1中，采用
13
C和
15
N双标所述多肽中的亮氨酸。
[0015]优选的，在S3中，加入序列修饰级胰蛋白酶对所述游离DNA
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生物素
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链霉亲和素磁珠复合物进行酶解，将酶解产物进行固相萃取，并用氮气吹干萃取物，而后将萃取物复溶；将复溶后样品进行HPLC
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MS/MS定量检测。
[0016]更优选的，将复溶后样品采用岛津Nexera X2高效液相色谱系统和AB Sciex 5500三重四级杆液质联用仪进行定量检测。
[0017]优选的，在S1和S2之间还包括如下步骤：将游离DNA单链进行生物素化，并评定生物素化效率；优选的，在S5中，计算酶解效率、SPE回收率，并根据生物素化效率、酶解效率及SPE回收率修正DNA浓度。
[0018]本专利技术第四个方面公开了上述的方法在基因领域中的应用。
[0019]本专利技术要解决的技术问题是提供一种安全可靠的游离DNA单链含量测定的方法，本专利技术方法可以对血清样品中游离DNA单链含量直接进行测定。
[0020]在本专利技术的一具体实施例中，上述同位素稀释质谱法测定游离DNA单链含量的方法，包括如下步骤：（1）将合成的游离DNA单链配成系列浓度标准溶液，用于建立标准曲线；（2）将合成的肽核酸探针配成溶液，用以捕获游离DNA单链；（3）将合成的同位素标记多肽（序列同肽核酸探针中肽段）配成溶液作为内标；（4）将游离DNA单链进行生物素化，并评定生物素化效率；（5）将上述生物素化的游离DNA单链与链霉亲和素磁珠反应，形成游离DNA单链
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生物素
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链霉亲和素磁珠复合物；（6）加入肽核酸探针捕获游离DNA单链
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生物素
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链霉亲和素磁珠复合物，磁性分离去除未结合探针；（7）加入序列修饰级胰蛋白酶对上述复合物进行酶解，将酶解产物进行固相萃取，并用氮气吹干萃取物，而后将萃取物复溶；（8）将复溶后样品进行HPLC
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MS/MS定量检测；（9）以不同浓度DNA标准品为横坐标，以肽核酸酶解肽段与同位素标记酶解肽段峰面积比为纵坐标建立标准曲线，根据二者峰面积比间接计算样本中DNA含量；
（10）计算酶解效率、SPE回收率，并根据生物素化效率、酶解效率及SPE回收率修正DNA浓度。
[0021]本专利技术所述同位素稀释质谱法测定游离DNA单链含量的方法，其中，所述步骤（1）具体包括如下步骤：游离DNA单链合成量为2OD值，在其中准确加入380μL DEPC水，配制成浓度为20μmol/L的游离DNA单链溶液至2.0mL离心管中。取100μL，并在其中加入900μL DEPC水稀释至浓度为2μmol/L作为贮存液并分装至2.0mL离心管中，每管分装100μL，并将分装好的游离DNA单链溶液置于
‑
70℃冰箱保存。使用前，用DEPC水将贮存液稀释成系列浓度用于建立标准曲线。
[0022]本专利技术所述同位素稀释质谱法测定游离DNA单链含量的方法，其中，所述步骤（2）具体包括如下步骤：肽核酸探针序列为5
’‑
GTGTAATTGGTCTCCGGAAACTTTAAC
‑3’‑
PEG2
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GDRALFVGEPNR，其中5
’‑
gtgtaattggtctccggaaactttaac
‑3’
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肽核酸探针，其特征在于，其中，所述肽核酸探针中的核酸部分序列如SEQ ID NO：1所示，所述肽核酸探针中的肽部分序列如SEQ ID NO：2所示；优选的，通过聚乙二醇连接所述核酸部分和肽部分得到肽核酸探针。2.根据权利要求1所述的肽核酸探针在同位素稀释质谱法定量检测游离DNA单链含量方法中的应用。3.一种同位素稀释质谱法定量检测游离DNA单链含量的方法，其特征在于，包括：S1：将合成的肽核酸探针配成溶液后，将合成的同位素标记多肽配成溶液作为内标；S2：将生物素化的游离DNA单链与链霉亲和素磁珠反应，形成游离DNA
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生物素
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链霉亲和素磁珠复合物；S3：加入肽核酸探针捕获所述游离DNA
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生物素
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链霉亲和素磁珠复合物，然后对所述游离DNA
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生物素
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链霉亲和素磁珠复合物进行酶解，将酶解产物固相萃取后复溶，定量检测；S4：以不同浓度DNA标准品为横坐标，以肽核酸酶解肽段与同位素标记酶解肽段峰面积比为纵坐标建立标准曲线，根据二者峰面积比间接计算样本中DNA含量；S5：修正DNA浓度得到最终浓度值。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S1之前还包括步骤S0：将合成的游离DNA单链配...

【专利技术属性】
技术研发人员：王峰，季伙燕，袁若愚，袁杰，吴安琪，李祎，鞠少卿，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：