系统技术方案

本公开描述了允许灵敏检测目的核酸(即，核苷酸序列是或包含靶序列的核酸)的技术。核苷酸序列是或包含靶序列的核酸)的技术。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】系统

技术介绍

[0001]开发可特异性检测目标核酸的技术变得越来越重要，尤其是当以非常低的丰度存在时。

技术实现思路

[0002]本公开描述了允许灵敏检测目标核酸(即，其核苷酸序列是或包含靶序列的核酸)的技术。
[0003]在一些实施方案中，提供的技术利用某些Cas酶的核酸切割活性特征；在许多实施方案中，提供的技术利用某些Cas酶的侧支切割活性。本公开确定了与某些先前开发的利用Cas的侧支切割活性的技术相关的问题的源头。本公开解决了此类问题，并且此外提供了相对于可选的可用系统具有意想不到的好处和/或能力的技术。
[0004]重要的是，在许多实施方案中，本公开提供了将序列检测与通过Cas酶的切割活化解偶联的技术。因此，本公开代表了与大多数基于Cas的技术系统的显著背离，集中于Cas酶的标志：它们的活性可以通过对指导RNA序列的操纵而特异性地针对任何目标序列。
[0005]在一些实施方案中，本公开提供了这样的见解，即通过采取相反的方法
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使用Cas系统来检测特定序列但不工程化Cas指导RNA以与该序列杂交，可以实现某些优势和/或可以解决问题。在一些实施方案中，本公开传授了基于连接的系统用于初始靶核酸杂交的用途，其中设计该基于连接的系统的组件以使得连接事件产生作为Cas侧支切割活性的活化核酸的一个或多个核酸分子或模板。提供的系统允许所述活化核酸具有不需要在原始靶核酸中发现的序列。因此，在一些实施方案中，本公开提供了可以利用一种或相对少量的指导RNA序列来检测多种不同的目标核酸靶标(包括与其他核酸序列相差单个碱基的靶标)的技术。
[0006]可选地或另外地，在一些实施方案中，本公开提供了允许核酸检测的策略，即使有显著的(例如，阿托摩尔)灵敏性，也无需扩增初始靶核酸。
[0007]除其他事项外，所提供的技术的优点包括(i)可以消除靶核酸的预扩增，从而去除可能曲解测定结果的序列突变的潜在来源(例如，通过产生假阳性和/或假阴性读数)；(ii)将靶检测与Cas侧支活性的活化解偶联避免针对每个目标靶序列特异性设计不同gRNA的需要；(iii)将Cas侧支活性的活化与靶检测解偶联进一步允许在选择Cas系统方面的灵活性，因为可以产生和/或利用活化核酸的DNA和RNA之一或两者；(iv)连接特异性使能够进行单个碱基判别；(v)将靶检测与Cas侧支活性的活化解偶联允许(除其他事项外)Cas活化序列(即，由gRNA/crRNA结合的序列)的多聚化，从而潜在地允许多种Cas酶从单个连接产物(或其模板或拷贝)活化；以及(vi)其组合。
附图说明
[0008]图1A和图1B一起描绘了根据本公开的核酸检测的示例性实施方案。
[0009]图2描绘了根据本公开的核酸检测的示例性实施方案。
[0010]图3展示了SHERLOCK
TM
过程(上图，来自Science 356:438,2017)和本文所述的使用基于连接的转录活化和CRISPR侧支活性进行核酸检测的技术(下图)的比较。
[0011]图4描绘了所产生的aRNA的速率和/或量增加的示例性实施方案。
[0012]图5描绘了如本文所述的多路分析的示例性实施方案。
[0013]图6描绘了如本文所述的多路分析的示例性实施方案，包括对可以如何实施这种分析进行了说明，例如，经由流体系统，例如像蜂窝系统(例如，如在Cepheid的美国专利申请US2014/0087958中所述)。
[0014]图7描绘了具有不同位置的Cas识别元件的示例性连接寡核苷酸组。Hyb
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Cas：Cas靶区域上游的杂交区域，T7启动子和Cas靶位于不同的链上；Cas
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Hyb：Cas靶区域下游的杂交区域，T7启动子和Cas靶位于相同的链上。
[0015]图8描绘了为确保从ssDNA传感器高效产生RNA而测试的不同的报告基因类型(RNA、由RNA聚合酶转录的dsDNA和原位转化为dsDNA的ssDNA)。
[0016]图9证明了从图8所述的序列产生的RNA报告基因的Cas13检测。
[0017]图10A和图10B证明了当靶杂交区域位于Cas靶序列的上游或下游时，成功的靶RNA检测。
[0018]图11A和图11B证明了由单链的DNA(ssDNA)对Lwa Cas13活性的活化。
[0019]定义
[0020]氨基酸：如本文所用，在其最宽泛的意义上，是指可掺入多肽链中的任何化合物和/或物质，例如，通过形成一个或多个肽键。在一些实施方案中，氨基酸具有通用结构H2N
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C(H)(R)
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COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是非天然氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是D
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氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是L
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氨基酸。“标准氨基酸”是指天然存在的肽中常见的二十种标准L
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氨基酸中的任何一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸之外的任何氨基酸，无论其是合成制备的还是从天然来源获得的。在一些实施方案中，与上述通用结构相比，多肽中的氨基酸(包括羧基端和/或氨基端的氨基酸)可包含结构修饰。例如，在一些实施方案中，与通用结构相比，氨基酸可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、聚乙二醇化、糖基化、磷酸化和/或取代(例如氨基基团、羧酸基团、一个或多个质子和/或羟基基团的取代)而修饰。在一些实施方案中，与包含其他方面相同的未经修饰的氨基酸的多肽相比，此类修饰可以例如改变包含经修饰的氨基酸的多肽的循环半衰期。在一些实施方案中，与包含其他方面相同的未经修饰的氨基酸的多肽相比，这种修饰不会显著改变含有经修饰的氨基酸的多肽的相关活性。从上下文可以清楚地看出，在一些实施方案中，术语“氨基酸”可用于指游离氨基酸；在一些实施方案中，它可用于指多肽的氨基酸残基。
[0021]类似物：如本文所用，术语“类似物”是指与参考物质共享一种或多种特定结构特征、元素、组分或部分的物质。典型地，“类似物”显示出与参考物质的显著结构相似性，例如共享核心或共有结构，但在某些离散方式上也有所不同。在一些实施方案中，类似物是可以从参考物质产生的物质，例如，通过参考物质的化学操纵。在一些实施方案中，类似物是可通过进行与产生参考物质的合成方法基本相似(例如，与其共享多个步骤)的合成方法而产生的物质。在一些实施方案中，类似物是或可以通过进行与用于产生参考物质的合成方法不同的合成方法来产生。
[0022]相关：两个事件或实体彼此“相关”，如果一者的存在、水平和/或形式与另一者的存在、水平、程度、类型和/或形式关联，则在本文中使用这个术语。例如，如果特定实体(例如多肽、遗传签名、代谢物、微生物等)的存在、水平和/或形式与疾病、病症或疾患的发生率和/或易感性关联(例如，在相关群体中)，则认为所述特定实体与所述特定疾病、病症或疾患相关。在一些实施方案中，如果两个或更多个实体直接或间接地相互作用，使它们本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种系统，所述系统包括：具有不同核苷酸序列的多个核酸分子；连接寡核苷酸组，所述连接寡核苷酸组包含：第一连接寡核苷酸，其核苷酸序列包括模板元件和第一靶杂交元件；和第二连接寡核苷酸，其核苷酸序列包括第二靶杂交元件和Cas识别元件；以及任选地一个或多个桥接寡核苷酸，其核苷酸序列是或包括一个或多个另外的靶杂交元件，其中所述靶杂交元件结合至共同靶位点的不同部分，使得当所述多个核酸分子包括至少一个其核苷酸序列包括所述靶位点的核酸分子时，所述连接寡核苷酸组则与所述靶位点杂交并且形成易于与连接酶连接的有缺口的核酸链，从而产生连接链。2.如权利要求1所述的系统，所述系统进一步包括连接酶。3.如权利要求1所述的系统，其中所述寡核苷酸中的一个或多个与固体支持物缔合。4.如权利要求1所述的系统，其中所述多个核酸与固体支持物缔合。5.如权利要求1所述的系统，所述系统进一步包括与第一连接寡核苷酸组不同的、指向第二靶位点的第二连接寡核苷酸组。6.如权利要求5所述的系统，其中所述第一连接寡核苷酸组和第二连接寡核苷酸组的模板元件是相同的。7.如权利要求5所述的系统，其中所述第一连接寡核苷酸组和第二连接寡核苷酸组的模板元件是不同的。8.如权利要求5
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7中任一项所述的系统，其中所述第一连接寡核苷酸组和第二连接寡核苷酸组的Cas识别元件是相同的。9.如权利要求5
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7中任一项所述的系统，其中所述第一连接寡核苷酸组和第二连接寡核苷酸组的Cas识别元件是不同的。10.如权利要求1所述的系统，其中所述模板元件是或包括启动子或其补体。11.如权利要求1所述的系统，其中所述模板元件是或包括复制起点或其补体。12.如权利要求1所述的系统，其中所述模板元件是或包括第一可延伸引物的结合位点。13.如权利要求12所述的系统，所述系统进一步包括第一可延伸引物。14.如权利要求12或权利要求13所述的系统，所述系统进一步包括DNA聚合酶。15.如权利要求12或权利要求13所述的系统，其中所述第二连接寡核苷酸具有包括第二可延伸引物的结合位点的补体的序列。16.如权利要求15所述的系统，所述系统进一步包括第二可延伸引物。17.如权利要求16所述的系统，所述系统进一步包...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：夏洛克生物公司，
类型：发明
国别省市：