稻瘟灵含量检测用半抗原、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种稻瘟灵含量检测用半抗原、制备方法及其应用，具体涉及一种稻瘟灵酶联免疫检测用半抗原，本发明专利技术还公开了所述半抗原的制备方法及其在抗体、试剂盒方面的应用。基于稻瘟灵半抗原建立的酶联免疫试剂盒快速检测产品，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量的样本，适用于农产品尤其在烟草中稻瘟灵的现场监控和大量样本的筛查。量样本的筛查。

【技术实现步骤摘要】
稻瘟灵含量检测用半抗原、制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及农药残留检测
，特别是一种稻瘟灵含量检测用半抗原、制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]稻瘟灵(Isoprothiolane)又名异丙硫环、富士一号，化学名称1,3
‑
二硫戊环
‑2‑
亚基丙二酸二异丙酯，是一种高效内吸性杀菌剂，其杀菌谱较窄，是防治稻瘟病的特效药，特别是对穗颈瘟具有优良效果，能通过植物的根、茎、叶各个部位内吸传导，并能达到心叶。其对稻苗瘟和小球菌核病也均有效，大面积使用还可兼治稻飞虱、叶蝉，并对植物生长有调节作用。但随着稻瘟灵的大量施用，可能会污染环境，且增大其在农产品中的残留量，并对人类健康形成潜在威胁。现多需对各类农产品中稻瘟灵残留量进行有效、准确的检测。
[0003]水果、蔬菜、烟草产品中稻瘟灵残留问题受到越来越多的关注。我国针对不同农作物，制定了稻瘟灵最大残留限量标准，其中西瓜的最大残留限量为0.1mg/kg，大米的最大残留限量为1mg/kg，烟草的最大残留限量为2mg/kg。
[0004]目前，现有文献中只出现对谷物、水果、蔬菜中这类杀菌剂残留量的检测报道，而没有见到有关烟叶中残留量的测定方法的报道。国内外对稻瘟灵残留的现有检测方法主要有气相色谱
‑
质谱联用(GC
‑
MS)、高效液相色谱
‑
质谱联用(HPLC
‑
MS)、气相色谱法(GC)等。此类仪器分析方法具有检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗时，样品还需提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员进行操作和管理，无法进行现场大规模快速检测，时效性差，难以推广。
[0005]免疫学检测分析技术以其高灵敏、高特异性、快速、操作简便等优点，已被药物残留检测领域广泛应用，与仪器检测方法相比具有很多优势。但现有技术中缺乏对稻瘟灵具有特异性反应的检测试剂，阻碍了免疫分析检测法在稻瘟灵检测中的运用。
[0006]在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测稻瘟灵时，关键技术在于能够获取特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件是需要合成、制备出合适的稻瘟灵半抗原。但是，目前国内还没有针对稻瘟灵半抗原的相关报道。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供了一种稻瘟灵含量检测用半抗原、制备方法及其应用，用于解决现有技术中存在的缺乏对稻瘟灵成分具有特异反应的抗体及合成抗体所需半抗原的技术问题。
[0008]本专利技术提供了一种稻瘟灵含量检测用半抗原，化学式为：2
‑
(2
‑
(1,3
‑
二异丙醚
‑
1,3
‑
二氧丙烷
‑2‑
亚基)
‑
1,3
‑
二硫戊环)乙酸；化学结构式为：
[0009][0010]具有该结构式的半抗原按现有技术中常用方法处理后可制得抗体，该抗体能对经过预处理后的各类农产品样本中所含稻瘟灵产生特异性反应。根据该特性可对稻瘟灵标准品配制溶液后，梯度稀释获得不同浓度稻瘟灵样品后，采用酶标仪在450nm下测量各样本的OD值得到标准曲线后，对待测样本进行预处理后，测定相同波长下的OD值，并通过标准曲线得到对应的浓度，从而实现对样本中所含稻瘟灵含量的定量有效、快速检测。本专利技术提供半抗原产品如图2所示。
[0011]例如对于样本的预处理，以烟叶为例，具体包括以下步骤：用均质器均质烟叶样本；称取1.0g
±
0.05g均质后的烟叶样本至50mL聚苯乙烯离心管中，加入5mL甲醇溶液，用振荡器振荡5min，混匀，3000g室温(20～25℃)离心10min；移取10μL上层清液至2mL聚苯乙烯离心管中，加入1990μL复溶液，涡旋仪涡动30s，混匀；取50μL用于分析(稀释倍数：1000)。
[0012]本专利技术另一方面还提供了一种上述半抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0013]在强碱反应环境下，以丙二酸二异丙酯为原料与二硫化碳和3,4
‑
二氯丁酸进行缩合反应，得到稻瘟灵含量检测用半抗原。
[0014]采用该反应能获得纯度较高的半抗原。该制备方法中所用试剂及反应条件，可按现有缩合反应所需的试剂和条件进行选择。
[0015]优选的，包括以下步骤：
[0016]1)丙二酸二异丙酯与二硫化碳在室温下搅拌混匀后，加强碱溶液后室温下搅拌1h后，加入3,4
‑
二氯丁酸并补加强碱溶液、四丁基溴化铵和乙腈，得到原料液；
[0017]2)对原料液加热回流反应4h后停止反应，得到反应液；
[0018]3)对所得反应液进行旋蒸、提纯分离得到所述稻瘟灵含量检测用半抗原。
[0019]反应方程式如式(2)：
[0020][0021]由上可知，该反应可以正常发生，并制得具有上述结构的半抗原。
[0022]优选的，步骤3)中所述旋蒸操作包括以下步骤：旋蒸除去反应液中乙腈和二硫化
碳后加水和酸溶液，调节反应液pH值到6。
[0023]优选的，步骤3)中所述提出分离步骤包括以下步骤：以乙酸乙酯为溶剂萃取反应液三次后合并所得有机相，水洗有机相，无水硫酸钠干燥蒸干，得到黄色油状物，上硅胶柱，用体积比为3:1的石油醚
‑
乙酸乙酯混合溶液洗脱分离纯化，得到所述稻瘟灵含量检测用半抗原。
[0024]优选的，所用强碱溶液为2mol/L KOH溶液；所述酸溶液为6mol/L HCl溶液；每次萃取所用溶剂的体积为100mL。
[0025]为实现对半抗原的有效应用，可进行以下应用：
[0026]本专利技术另一方面还提供了一种稻瘟灵含量检测用抗原，为由上述所述半抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物。
[0027]本专利技术中所用半抗原与载体蛋白偶联方法可以为现有常用由半抗原制备抗原的方法，例如以牛血清蛋白为载体的偶联方法可以为：
[0028]取上述半抗原12.9mg，加1mL四氢呋喃溶解澄清，加N
‑
羟基丁二酰亚胺(NHS)8.5mg、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)14.8mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白(BSA)50mg，加0.1mol/L CB9.1 8mL溶解，得到B液；将A液逐滴滴加到B液中，室温反应4h，停止反应，用0.02mol/L PBS缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心，得到与牛血清白蛋白偶联的稻瘟灵人工抗原，分装，
‑
20℃保存。
[0029]以卵清蛋白为载体的偶联方法包括以下步骤：
[0030]取上述的稻瘟灵半抗原7.7mg，加1mL二甲基亚砜(DMSO)溶解澄清，加NHS 5.1mg、EDC 9.7mg，充分溶解本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种稻瘟灵含量检测用半抗原，其特征在于，化学式为：2
‑
(2
‑
(1,3
‑
二异丙醚
‑
1,3
‑
二氧丙烷
‑2‑
亚基)
‑
1,3
‑
二硫戊环)乙酸；化学结构式为：2.一种如权1中所述半抗原的制备方法，包括以下步骤：在强碱反应环境下，以丙二酸二异丙酯为原料与二硫化碳和3,4
‑
二氯丁酸进行缩合反应，得到稻瘟灵含量检测用半抗原。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)丙二酸二异丙酯与二硫化碳在室温下搅拌混匀后，加强碱溶液后室温下搅拌1h后，加入3,4
‑
二氯丁酸并补加强碱溶液、四丁基溴化铵和乙腈，得到原料液；2)对原料液加热回流反应4h后停止反应，得到反应液；3)对所得反应液进行旋蒸、提纯分离得到所述稻瘟灵含量检测用半抗原。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中所述旋蒸操作包括以下步骤：旋蒸除去反应液中乙腈和二硫化碳后加水和酸溶液，调节反应液pH值到6；优选的，所用强碱溶液为2mol/L KOH溶液；所述酸溶液为6mol/L HCl溶液；每次萃取所用溶剂的体积为100mL。5.一种稻瘟灵含量检测用抗原，其特征在于，为由如权利要求2～4中任一项所述方法制备得到的或如权利要求1中所述半抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物。6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：王春琼，陈丹，张燕，秦世春，李苓，蔡洁云，张轲，张晓伟，彭丽娟，孙浩巍，杨艺敏，张庆刚，
申请(专利权)人：云南省烟草质量监督检测站，
类型：发明
国别省市：