一种基于RNA连接标签的低样本量m6A高通量测序方法技术

本发明专利技术公开了一种基于RNA连接标签的低样本量m6A高通量测序方法，属于RNA的高通量测序领域。本发明专利技术方法包括以下步骤：将含有不同barcode标签序列的3

【技术实现步骤摘要】
一种基于RNA连接标签的低样本量m6A高通量测序方法


[0001]本专利技术涉及RNA的高通量测序领域，具体涉及一种基于RNA连接标签的低样本量m6A 高通量测序方法。

技术介绍

[0002]生物大分子的合成后修饰在许多生命进程中都发挥着重要的作用，其中N6‑
甲基化腺苷 (m6A)是真核生物信使脱氧核酸(mRNA)中含量最高的转录后RNA修饰。m6A修饰水平在哺乳动物细胞中是动态可逆的，受多种m6A相关蛋白的调控。前期研究表明m6A的动态调节过程与生命生理过程密切相关，且m6A的失调也被证明会导致一些疾病相关的病理变化。 m6A的整体含量可以通过对RNA样品进行酶解后利用LC
‑
MS获得，然而由于m6A对mRNA 几乎所有的代谢过程(如mRNA的形成，加工，转运，翻译，降解等)均有重要作用，因此对m6A修饰的定位以及其在特定位点上的修饰水平变化的研究具有重要意义。在核酸生物大分子的研究中，对特定位点的基因序列的定性定量分析通常通过测序来实现。与一代测序技术相比，二代测序技术可以以低成本、99％以上的准确度，1次可对几百、几千个样本的几十万至几百万条DNA分子同时进行快速测序分析，从而降低测序成本，提高测序通量，更适合对多个样本进行测序分析。同时，m6A特异性识别抗体的发现大大推进了转录组水平上 m6A修饰位点的相关研究。通过将m6A特异性识别抗体用于免疫共沉淀，并与高通量测序技术结合发展的测序方法MeRIP
–
Seq(Methylated RNA immunoprecipitation followed bysequencing)实现了转录组范围的m6A定位，推动了m6A的分子机理和作用机制的研究。然而，由于MeRIP
‑
seq等利用m6A特异性识别抗体的高通量测序方法受抗体免疫沉淀的效率以及m6A修饰含量本身较低的情况影响，对于单个临床外周血样本(2
‑
4mL全血样本)难以实现m6A
‑
seq。
[0003]条形码标签(Barcode)标记技术以其可以对多个样品进行标记的优势极大程度地促进了单细胞测序的发展。对单个细胞的RNA或DNA进行barcode标记、混合后可以进行转录组，基因组或基因组合成后修饰的测序，在对测序数据进行生物信息学分析时，可以通过不同的 barcode标签序列对测序数据进行拆分，并溯源到初始样本的每一个细胞。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种基于RNA连接barcode标签的多个低样本量样本m6A高通量测序方法，以同时实现多个临床低样本量样品的混合m6A抗体免疫沉淀以及建库测序。
[0005]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0006]一种基于RNA连接barcode标签的多个低样本量样本m6A高通量测序方法，包括以下步骤：
[0007](1)将含有不同barcode标签序列的建库用3
’
连接体寡核苷酸链(3
’
linker)进行磷酸化处理、腺苷化处理。所述的3
’
linker的组成为5
’‑
barcode序列
‑
随机序列
‑
PCR引物接头序列
‑3’
。
[0008](2)将步骤(1)腺苷化处理后含有不同barcode标签序列的3
’‑
linker分别连接到
不同来源的打断后的RNA样品上，混合样品并纯化后留出input对照样品用于RNA
‑
seq，并对剩余混合样品进行m6A抗体免疫沉淀得到IP样品用于m6A
‑
seq，最终得到input和IP样品的二代测序文库并测序。
[0009](3)对混合样品的测序数据根据barcode序列进行拆分，并利用生物信息学分析手段对数据进行分析，得到初始单个样本的RNA
‑
seq及m6A
‑
seq信息。
[0010]优选的，步骤(1)中，所述的3
’
linker进行磷酸化处理以及腺苷化处理后均进行了纯化，以减少不同反应间的相互干扰。其中，利用T4 PNK酶在反应体系中含有ATP的条件下对 3
’‑
linker进行磷酸化处理，利用5
’
腺苷化试剂对磷酸化处理后的3
’‑
linker进行腺苷化处理，利用寡核苷酸纯化浓缩试剂盒进行纯化。
[0011]优选的，步骤(1)中，所述的随机序列为6个碱基的随机序列，以确保barcode序列在测序过程中的准确性。所述的barcode序列优选由6个碱基组成，序列设计上避开与商品化的二代测序文库构建所用PCR引物的Index序列发生重复，并尽量保证ATGC四个碱基的分布较为均匀，避免出现单个碱基多次重复(如GGGG)的情况。
[0012]进一步地，步骤(2)包括如下步骤：
[0013]1)从样品(细胞/血液样品/组织样品等)中提出RNA。
[0014]2)利用化学离子打断的方法将RNA样品打断成200
‑
400bp片段，并通过纯化除去打断试剂，再利用酶将打断的RNA3
’
端的磷酸基团除掉以及在5
’
端加上磷酸基团。
[0015]3)将含有不同barcode标签的腺苷化处理后的3
’‑
linker连接到不同的打断后的RNA样品上，反应完成后除去多余的3
’‑
linker。
[0016]4)将不同样品进行混合并纯化，留出input样品后对剩余样品进行m6A抗体免疫沉淀获得IP样品，对input样品和IP样品进行逆转录，除去逆转录引物及模板后纯化获得cDNA。
[0017]5)在cDNA上连接5
’
接头，对反应体系进行纯化后利用RT
‑
qPCR确定构建文库PCR所需的循环数。
[0018]6)以连接了5
’‑
接头的cDNA作为底物进行PCR构建文库，利用切胶回收对产物进行纯化，得到二代测序文库，将纯化后的文库送往测序公司进行测序。
[0019]优选地，步骤1)中，采用tizol试剂对样品中的RNA进行提取。
[0020]优选地，步骤2)中，采用镁离子化学打断试剂对RNA进行打断，并利用RNA纯化浓缩试剂盒对打断后RNA进行纯化，纯化后的RNA片段利用T4 PNK酶进行末端修复。
[0021]优选地，步骤3)中，利用T4 RNA连接酶2(截短型KQ)进行过夜反应将腺苷化处理后的3
’‑
linker连接到打断后的RNA样品上。反应完成后利用5
’
去腺苷化酶和RecJf酶除去多余的3
’‑
linker。
[0022]优选地，步骤4)中，将步骤3)中多个反应混合物直接混合，随后利用RNA纯化浓缩试剂盒对反应体系本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于RNA连接barcode标签的多个低样本量样本m6A高通量测序方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将含有不同barcode标签序列的建库用3
’
linker进行磷酸化处理、腺苷化处理；所述的3
’
linker的组成为5
’‑
barcode序列
‑
随机序列
‑
PCR引物接头序列
‑3’
；(2)将步骤(1)腺苷化处理后含有不同barcode标签序列的3
’‑
linker分别连接到不同来源的打断后的RNA样品上，混合样品并纯化后留出input对照样品用于RNA
‑
seq，并对剩余混合样品进行m6A抗体免疫沉淀得到IP样品用于m6A
‑
seq，最终得到input和IP样品的二代测序文库并测序；(3)根据barcode序列对测序数据进行拆分，并进行分析，得到初始单个样本的RNA
‑
seq及m6A
‑
seq信息。2.根据权利要求1所述的基于RNA连接barcode标签的多个低样本量样本m6A高通量测序方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的3
’
linker进行磷酸化处理、腺苷化处理后均进行了纯化。3.根据权利要求1所述的基于RNA连接barcode标签的多个低样本量样本m6A高通量测序方法，其特征在于：步骤(1)中，利用T4 PNK酶对3
’‑
linker进行磷酸化处理，利用5
’
腺苷化试剂对磷酸化处理后的3
’‑
linker进行腺苷化处理。4.根据权利要求1所述的基于RNA连接barcode标签的多个低样本量样本m6A高通量测序方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的随机序列为6个碱基的随机序列。5.根据权利要求1所述的基于RNA连接barcode标签的多个低样本量样本m6A高通量测序方法，其特征在于：步骤(2)包括如下步骤：1)从样品中提出RNA；2)利用化学离子打断的方法将RNA样品打断成200
‑
400bp的片段，并通过纯化除去打断试剂，再...

【专利技术属性】
技术研发人员：周翔，翁小成，秦珊珊，韩少卿，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：