一种基于mSNP技术检测白萝卜种子纯度的混样检测方法技术

本发明专利技术涉及一种基于mSNP技术检测白萝卜种子纯度的混样检测方法，其利用引物对1F/R～20F/R进行，所述引物对1F/R～20F/R的基因序列见SEQ ID No.1～40；本发明专利技术采用mSNP技术，在扩增子不变的情况下，可以检测到更多的SNP变异；采用混样的方法进行检测，在减少扩增工作量的同时降低了测序成本，也加快了检测速度，可在一天时间内最多完成1440粒种子的检测。本方法是利用测序技术直接读取单核苷酸多态，通过程序直接进行纯度结果的判读，结果直观，可靠，避免受种子发育期、及结果判读时主观因素的影响。响。

【技术实现步骤摘要】
一种基于mSNP技术检测白萝卜种子纯度的混样检测方法


[0001]本专利技术属于种子纯度检测领域，具体涉及一种基于mSNP技术检测白萝卜种子纯度的混样检测方法。

技术介绍

[0002]白萝卜是十字花科萝卜属一年生作物，染色体数目18对，营养成分丰富，在世界各地均有种植，开发价值较大。中国是白萝卜的发源地，是我国重要的蔬菜之一，已有2700年以上的栽培历史，具有丰富的种质资源。
[0003]随着市场种子产业的兴起，种子产品日渐丰富，种子的生产经营单位也越来越多，市场上种子纯度问题普遍存在，严重干扰市场秩序。种子纯度为本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率。为对种子进行有效区分，保证种子纯度，在萝卜杂交种的新品种推广中一般要试种一季，通过田间种植的方法确定杂交种的纯度之后才能在市场上推广应用，这个过程不仅增加了田间管理和储藏成本，而且延误了种子上市的时机。为了加快优质种质的上市，促进萝卜产业的发展，对快速准确的的种子纯度鉴定方法有迫切的需求。
[0004]种子纯度鉴定经过形态学、生物化学水平，已经进入了DNA水平的研究水平。DNA分子标记信息量大、遗传性稳定、不易受内外环境影响、可以直接反映DNA在分子水平上的遗传变异、对所需的DNA样品量较少、操作方便，是可用于应用的理想的检测方法。得益于DNA分子标记的诸多优点，近年来在作物领域如水稻、小麦等物种的种子纯度鉴定中应用已经比较广泛。常用的分子标记RAPD、SSR、RFLP等；RFLP是最早出现的第一代分子标记，优点是遗传信息丰富、稳定性和重复性较好；缺点是费时、对DNA样本的质量要求高、需要用到放射性探针等。SSR标记的优点是重复性高、多态丰富、共显性、操作简单；缺点是引物设计及筛选工作量较大，成本较高。RAPD标记优点是操作灵活、所需的DNA样品少、操作方便；缺点是对实验条件依赖度高，影响结果的可靠性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种基于mSNP技术检测白萝卜种子纯度的混样检测方法，其高效、准确、成本低。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
[0007]技术方案一：
[0008]一种于mSNP技术的白萝卜种子纯度检测的引物组，其特征在于，其包括引物对1F/R、引物对2F/R、引物对3F/R、引物对4F/R、引物对5F/R、引物对6F/R、引物对7F/R、引物对8F/R、引物对9F/R、引物对10F/R、引物对11F/R、引物对12F/R、引物对13F/R、引物对14F/R、引物对15F/R、引物对16F/R、引物对17F/R、引物对18F/R、引物对19F/R、引物对20F/R；其中每条引物对均由正向引物和反应引物组成；
[0009]所述引物对1F/R中，F引物的序列SEQI DNo.1所示，R引物的序列如SEQI DNo.2所示；
[0010]所述引物对2F/R中，F引物的序列SEQI DNo.3所示，R引物的序列如SEQI DNo.4所示；
[0011]所述引物对3F/R中，F引物的序列SEQI DNo.5所示，R引物的序列如SEQI DNo.6所示；
[0012]所述引物对4F/R中，F引物的序列SEQI DNo.7所示，R引物的序列如SEQI DNo.8所示；
[0013]所述引物对5F/R中，F引物的序列SEQI DNo.9所示，R引物的序列如SEQI DNo.10所示；
[0014]所述引物对6F/R中，F引物的序列SEQI DNo.11所示，R引物的序列如SEQI DNo.12所示；
[0015]所述引物对7F/R中，F引物的序列SEQI DNo.13所示，R引物的序列如SEQI DNo.14所示；
[0016]所述引物对8F/R中，F引物的序列SEQI DNo.15所示，R引物的序列如SEQI DNo.16所示；
[0017]所述引物对9F/R中，F引物的序列SEQI DNo.17所示，R引物的序列如SEQI DNo.18所示；
[0018]所述引物对10F/R中，F引物的序列SEQI DNo.19所示，R引物的序列如SEQI DNo.20所示；
[0019]所述引物对11F/R中，F引物的序列SEQI DNo.21所示，R引物的序列如SEQI DNo.22所示；
[0020]所述引物对12F/R中，F引物的序列SEQI DNo.23所示，R引物的序列如SEQI DNo.24所示；
[0021]所述引物对13F/R中，F引物的序列SEQI DNo.25所示，R引物的序列如SEQI DNo.26所示；
[0022]所述引物对14F/R中，F引物的序列SEQI DNo.27所示，R引物的序列如SEQI DNo.28所示；
[0023]所述引物对15F/R中，F引物的序列SEQI DNo.29所示，R引物的序列如SEQI DNo.30所示；
[0024]所述引物对16F/R中，F引物的序列SEQI DNo.31所示，R引物的序列如SEQI DNo.32所示；
[0025]所述引物对17F/R中，F引物的序列SEQI DNo.33所示，R引物的序列如SEQI DNo.34所示；
[0026]所述引物对18F/R中，F引物的序列SEQI DNo.35所示，R引物的序列如SEQI DNo.36所示；
[0027]所述引物对19F/R中，F引物的序列SEQI DNo.37所示，R引物的序列如SEQI DNo.38所示；
[0028]所述引物对20F/R中，F引物的序列SEQI DNo.39所示，R引物的序列如SEQI DNo.40所示。
[0029]进一步的，引物对1F/R～20F/R由mSNP技术获得。
[0030]技术方案二：
[0031]一种根据上述的引物组检测白萝卜种子纯度的混样检测方法，其包括如下步骤：
[0032]步骤1、选材：选取1个或多个白萝卜品种；每份份白萝卜样品至少采用96粒种子；
[0033]步骤2、对白萝卜基因组DNA进行准确定量；
[0034]步骤3、将所述的引物组中进行引物合成，每个引物对中的正向引物和反向引物合成时，均合成10条带有不同目标标签的引物；然后按照指定的标签组合进行引物的混合制备引物混合液；
[0035]步骤4、以白萝卜基因组DNA为模板，用引物混合液分别对白萝卜的基因组DNA进行一轮PCR扩增，获得目标区域；
[0036]步骤5、将所获得的PCR扩增产物，进行等量混合；
[0037]步骤6、混合后的产物进行片段筛选；
[0038]步骤7、对筛选后所得体系中的单链DNA进行消化；
[0039]步骤8、对消化后的产物进行纯化；
[0040]步骤9、在步骤8中获得的体系中配置二轮PCR体系；
[0041]步骤10、对二轮PCR产物进行纯化，完成测序文库的制备；
[0042]步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于mSNP技术的白萝卜种子纯度检测用引物组，其特征在于，其包括引物对1F/R、引物对2F/R、引物对3F/R、引物对4F/R、引物对5F/R、引物对6F/R、引物对7F/R、引物对8F/R、引物对9F/R、引物对10F/R、引物对11F/R、引物对12F/R、引物对13F/R、引物对14F/R、引物对15F/R、引物对16F/R、引物对17F/R、引物对18F/R、引物对19F/R、引物对20F/R；其中每条引物对均由正向引物和反应引物组成；所述引物对1F/R中，F引物的序列SEQ ID No.1所示，R引物的序列如SEQ ID No.2所示；所述引物对2F/R中，F引物的序列SEQ ID No.3所示，R引物的序列如SEQ ID No.4所示；所述引物对3F/R中，F引物的序列SEQ ID No.5所示，R引物的序列如SEQ ID No.6所示；所述引物对4F/R中，F引物的序列SEQ ID No.7所示，R引物的序列如SEQ ID No.8所示；所述引物对5F/R中，F引物的序列SEQ ID No.9所示，R引物的序列如SEQ ID No.10所示；所述引物对6F/R中，F引物的序列SEQ ID No.11所示，R引物的序列如SEQ ID No.12所示；所述引物对7F/R中，F引物的序列SEQ ID No.13所示，R引物的序列如SEQ ID No.14所示；所述引物对8F/R中，F引物的序列SEQ ID No.15所示，R引物的序列如SEQ ID No.16所示；所述引物对9F/R中，F引物的序列SEQ ID No.17所示，R引物的序列如SEQ ID No.18所示；所述引物对10F/R中，F引物的序列SEQ ID No.19所示，R引物的序列如SEQ ID No.20所示；所述引物对11F/R中，F引物的序列SEQ ID No.21所示，R引物的序列如SEQ ID No.22所示；所述引物对12F/R中，F引物的序列SEQ ID No.23所示，R引物的序列如SEQ ID No.24所示；所述引物对13F/R中，F引物的序列SEQ ID No.25所示，R引物的序列如SEQ ID No.26所示；所述引物对14F/R中，F引物的序列SEQ ID No.27所示，R引物的序列如SEQ ID No.28所示；所述引物对15F/R中，F引物的序列SEQ ID No.29所示，R引物的序列如SEQ ID No.30所示；所述引物对16F/R中，F引物的序列SEQ ID No.31所示，R引物的序列如SEQ ID No.32所示；所述引物对17F/R中，F引物的序列SEQ ID No.33所示，R引物的序列如SEQ ID No.34所示；所述引物对18F/R中，F引物的序列SEQ ID No.35所示，R引物的序列如SEQ ID No.36所示；所述引物对19F/R中，F引物的序列SEQ ID No.37所示，R引物的序列如SEQ ID No.38所示；
所述引物对20F/R中，F引物的序列SEQ ID No.39所示，R引物的序列如SEQ ID No.40所示。2.一种根据权利要求1所述的引物组检测白萝卜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：步骤1、选材：选取1个或多个白萝卜品种；每份白萝卜样品至少采用96粒种子；步骤2、对白萝卜基因组DNA进行准确定量；步骤3、将权利要求1中所述的引物组中进行引物合成，每个引物对中的正向引物和反向引物合成时，均合成10条带有不同目标标签的引物；然后按照指定的标签组合进行引物的混合制备引物混合液；步骤4、以白萝卜基因组DNA为模板，用引物混合液分别对白萝卜的基因组DNA进行一轮PCR扩增，获得目标区域；步骤5、将所获得的PCR扩增产物，进行等量混合；步骤6、混合后的产物进行片段筛选；步骤7、对筛选后所得体系中的单链DNA进行消化；步骤8、对消化后的产物进行纯化；步骤9、在步骤8中获得的体系中配置二轮PCR体系；步骤10、对二轮PCR产物进行纯化，完成测序文库的制备；步骤11、将测序文库等质量混合后上机测序，获得测序数据；步骤12、对获得的测试数据，再次根据标签组合将样本拆分开；步骤13、识别测试样目标位点的基因型结果，通过位点基因型情况判定种子的纯度。3.根据权利要求2所述一种检测白萝卜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，步骤3中，引物对1F/R～20...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘田，许彦芬，高苗，李凝，张丛，张萌，郝军会，龚舒，刘景艺，
申请(专利权)人：石家庄博瑞迪生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：