一种棉花根腐病菌检测用引物、探针、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种棉花根腐病菌检测用引物、探针、试剂盒以及棉花根腐病菌的检测方法，其中，上游引物myaF序列为5

【技术实现步骤摘要】
一种棉花根腐病菌检测用引物、探针、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种棉花根腐病菌检测用引物、探针、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]由棉花根腐病菌[Phymototrichum omnivorum(Shear)Duggar]引起的棉花根腐病又名德克萨斯根腐病，1888年由Pammel首次报道于德克萨斯州。此病是棉花上一种破坏性很大的病害，根据美国国家棉花委员会提供的1980～2008病害损失评估价格数据，仅其一项每年就造成美国棉花产量高达1亿美金的损失。
[0003]据报道，棉花根腐病寄主已超过2000种以上，其中损失较大的是棉花、苜蓿、核果类果树和林荫树等。受侵染植物主根腐烂，茎部维管束变色，叶片快速萎蔫，叶片不脱落，最终导致植物死亡，病部产生大量菌核，菌核在土壤内至少存活5年，难以防治，病原菌可土传、病根传播。由于其危害严重性，棉花根腐病菌被东非、埃及、南部非洲、阿根廷、巴西、智利、巴拉圭、乌拉圭、巴林、哈萨克斯坦、乌兹别克斯坦、阿塞拜疆、摩尔多瓦、土耳其、乌克兰、亚太植物保护委员会(Asia and Pacific Plant Protection Commission，APPPC)、植物健康委员会(El Comit
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de Sanidad Vegetal，COSAVE)、欧亚经济联盟(Eurasian Economic Union，EAEU)、欧洲和地中海植物保护组织(European and Mediterranean Plant Protection Organization，EPPO)、欧盟(European Union，EU)等将其列入了A1检疫性名录，摩洛哥、突尼斯、墨西哥、以色列、白俄罗斯将其列为了检疫性有害生物，我国于2007年将其列入了《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。目前，该病菌在美国、墨西哥、利比亚、委内瑞拉等国家有分布，迄今，我国未见报道。近年来，随着我国引进优质的种子苗木，该病传入的机率越来越大，严重威胁我国的棉花生产和对外贸易。
[0004]目前，棉花根腐病菌的检测方法主要有传统的形态学法和基于PCR的分子生物学法。其中，形态学法中，虽然棉花根腐病菌的形态特征较为明显，例如，分生孢子外观上类似“担子”、可以产生菌丝索且侧生菌丝呈十字形分枝、以及可以产生棕色或黑色菌核等，但是诱导产孢、产菌核需要时间较长，只适合实验研究，无法满足口岸快速、准确检测的要求。分子生物学法中，Marek等设计了一对用于检测该病菌的特异性引物，但是该引物灵敏度不是很高，无法检测较低含量的DNA样品。Arif等建立了一种基于实时荧光PCR和Razorex生物监测系统的多基因检测方法，但是该方法需要与美国Idaho公司的Razor Ex BioDetection system生物监测系统配合使用，限制了该检测方法的推广应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种特异性好且灵敏度高的用于棉花根腐病菌检测的引物。
[0006]本专利技术所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种特异性好且灵敏度高的用于棉花根腐病菌检测的探针。
[0007]本专利技术所要解决的第三个技术问题是针对现有技术而提供一种用于棉花根腐病菌检测的试剂盒。
[0008]本专利技术所要解决的第四个技术问题是针对现有技术而提供一种重复性好且可靠性高的棉花根腐病菌的检测方法。
[0009]本专利技术解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种棉花根腐病菌检测用引物，其特征在于，所述棉花根腐病菌检测用引物的序列为：
[0010]上游引物myaF序列为5
’‑
GAGGGCATGCCTGTTCGA
‑3’
[0011]下游引物myaR序列为5
’‑
CCAAGCCAACCCTCTTTCAC
‑3’
。
[0012]为进一步解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：一种棉花根腐病菌检测用探针，其特征在于，所述棉花根腐病菌检测用探针的序列为：
[0013]myaT序列为5
’‑
CGTCAGCATAACAAAACCTCAAGCACCC
‑3’
。
[0014]进一步，所述myaT探针5
’
端标记的荧光报告基团为FAM，3
’
端标记的荧光猝灭基团为TAMRA。myaT探针5
’
端也可以采用TET、VIC、JOE等发光基团。
[0015]为进一步解决上述第三个技术问题所采用的技术方案为：一种棉花根腐病菌检测用试剂盒，其特征在于，包括如上所述的棉花根腐病菌检测用引物。
[0016]进一步，本专利技术中的棉花根腐病菌检测用试剂盒还包括如上所述的棉花根腐病菌检测用探针。
[0017]再进一步，本专利技术中的棉花根腐病菌检测用试剂盒还包括CTAB提取液、Taq DNA聚合酶、阳性对照液以及阴性对照液。
[0018]为进一步解决上述第四个技术问题所采用的技术方案为：一种棉花根腐病菌的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
[0019](1)将菌丝放入液氮中碾碎，加入CTAB提取液，65℃水浴30min；
[0020](2)10000r/min离心5min，取上清液并加入等体积的萃取液，混合至乳浊状；
[0021](3)4℃10000rpm离心5min，取上清液并加入醋酸钠溶液和乙醇，混匀后
‑
20℃下静置30min；
[0022](4)4℃10000rpm离心10min，取沉淀并用乙醇漂洗，晾干后，加入灭菌去离子水溶解沉淀，得到样品DNA，4℃保存备用；
[0023](5)以上述获得的样品DNA为模版，利用上述权利要求1中的引物及权利要求2或3中的探针进行PCR扩增反应，并对结果进行分析。
[0024]进一步，所述萃取液为氯仿和异戊醇混合液。
[0025]进一步优选地，所述氯仿和异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24:1。
[0026]进一步，所述步骤(5)中PCR扩增反应的条件为：50℃预热2min；95℃预变性10min；95℃ 15s，60℃ lmin，40个循环。
[0027]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术采用实时荧光PCR检测法来对棉花根腐病菌进行检测，与传统的检测方法相比，具有检测周期短、特异性与灵敏度高以及无需PCR后处理等优点，符合口岸检测快速、准确的要求。其中，本专利技术中的引物和探针具有扩增效率高、特异性好以及灵敏度高等优点，并且，本专利技术中的检测方法重复性好，检测结果可靠。
附图说明
[0028]图1为本专利技术实施例4中棉花根腐病菌实时荧光PCR检测图；
[0029]图2为本专利技术实施例5中实时荧光PCR特异性扩增曲线；
[0030]图3为本专利技术实施例5中实时荧光PCR扩增产物凝胶电泳；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种棉花根腐病菌检测用引物，其特征在于，所述棉花根腐病菌检测用引物的序列为：上游引物myaF序列为5
’‑
GAGGGCATGCCTGTTCGA
‑3’
，下游引物myaR序列为5
’‑
CCAAGCCAACCCTCTTTCAC
‑3’
。2.一种棉花根腐病菌检测用探针，其特征在于，所述棉花根腐病菌检测用探针的序列为：myaT序列为5
’‑
CGTCAGCATAACAAAACCTCAAGCACCC
‑3’
。3.如权利要求2所述的棉花根腐病菌检测用探针，其特征在于，其中，所述myaT探针5
’
端标记的荧光报告基团为FAM，3
’
端标记的荧光猝灭基团为TAMRA。4.一种棉花根腐病菌检测用试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的棉花根腐病菌检测用引物。5.如权利要求4所述的棉花根腐病菌检测用试剂盒，其特征在于，还包括如权利要求2或3所述的棉花根腐病菌检测用探针。6.如权利要求5所述的棉花根腐病菌检测用试剂盒，其特征在于，还包括CTAB提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：张慧丽，李雪莲，段维军，赵雷，陈先锋，
申请(专利权)人：宁波海关技术中心，
类型：发明
国别省市：