一种基于mSNP技术检测西瓜种子纯度的混样检测方法技术

本发明专利技术涉及一种基于mSNP技术检测西瓜种子纯度的混样检测方法，其利用引物对1F/R～22F/R进行，所述引物对1F/R～22F/R的基因序列见SEQ ID No.1～44；本发明专利技术采用mSNP技术，在扩增子不变的情况下，可以检测到更多的SNP变异；采用混样的方法进行检测，在减少扩增工作量的同时降低了测序成本，也加快了检测速度，可在一天时间内最多完成1440粒种子的检测。本方法是利用测序技术直接读取单核苷酸多态，通过程序直接进行纯度结果的判读，结果直观，可靠，避免受种子发育期、及结果判读时主观因素的影响。响。

【技术实现步骤摘要】
一种基于mSNP技术检测西瓜种子纯度的混样检测方法


[0001]本专利技术属于种子纯度检测领域，具体涉及一种基于mSNP技术检测西瓜种子纯度的混样检测方法。

技术介绍

[0002]西瓜是葫芦科葫芦属一年生草本植物，栽培历史悠久，分布地域广，是世界十大水果之一。我国西瓜的栽培面积和产量均居世界首位。自20世纪80年代西瓜杂交一代在我国推广，杂交种为西瓜的高产、稳产、优质做出巨大贡献，得到广泛的应用。由于国内种子经营渠道多、种子管理法制不健全，使得低纯度的种子在市场上时有销售。随着种植面积的增加，杂交种纯度问题越来越严重，给农业生产造成巨大的损失。
[0003]种子纯度是种子质量的核心指标，是保证西瓜正常生产的重要因素。种子纯度定义为本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率。目前市场上广泛用的种子为二倍体/三倍体杂交种，根据国家制定的《农作物种子质量标准》(GB16715.1
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2010)的规定，西瓜杂交种大田用种的纯度不低于95％。所以西瓜种子在上市之前进行纯度鉴定是质量控制的要求。
[0004]西瓜杂交种纯度鉴定最直接可靠的方法是田间种植鉴定，但这种方法易受环境的影响，鉴定周期长，且成本较高。西瓜杂交种大量上市一般在11月底，如果大棚种植西瓜想在5月上市，来不及种植鉴定。第二种方法是生化鉴定技术，包括同工酶和蛋白质电泳图谱鉴定。蛋白质电泳方法成熟、结果准确，但是由于西瓜遗传基础狭窄，蛋白种类有限，对亲缘关系很近的西瓜杂交种难以区分。同工酶电泳比蛋白质电泳灵敏度更高、更准确，但是存在时期特异性和器官特异性、需在低温下操作以及在葫芦科作物中同工酶位点非常有限等缺点。第三种方法是分子标记技术，是从DNA水平上来反映基因型的差异。这种方法具有其他两种方法不具备的优越性：直接以基因型的结果进行反映，准确可靠；不受发育时期和环境的影响；不存在表达的问题，可以鉴定表型难以区别的品种等。常用的分子标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等。RFLP多态性稳定，但需要的DNA量大、费用高且需要用到放射性同位素，严重制约了本方法的应用。RAPD操作简单、多态性好、应用范围广；但对反应条件、操作等要求极为严格，重复性差。SSR具有丰富的等位变异、重现性好和共显性遗传特性；但SSR引物开发需要成本较高，给SSR技术的开发和利用带来了一定阻碍。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种基于mSNP技术检测西瓜种子纯度的混样检测方法，其高效、准确、成本低。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
[0007]技术方案一：
[0008]一种于mSNP技术的西瓜种子纯度检测的引物组，其特征在于，其包括引物对1F/R、引物对2F/R、引物对3F/R、引物对4F/R、引物对5F/R、引物对6F/R、引物对7F/R、引物对8F/R、
引物对9F/R、引物对10F/R、引物对11F/R、引物对12F/R、引物对13F/R、引物对14F/R、引物对15F/R、引物对16F/R、引物对17F/R、引物对18F/R、引物对19F/R、引物对20F/R、引物对21F/R、引物对22F/R；其中每条引物对均由正向引物和反应引物组成；
[0009]所述引物对1F/R中，F引物的序列SEQIDNo.1所示，R引物的序列如SEQIDNo.2所示；
[0010]所述引物对2F/R中，F引物的序列SEQIDNo.3所示，R引物的序列如SEQIDNo.4所示；
[0011]所述引物对3F/R中，F引物的序列SEQIDNo.5所示，R引物的序列如SEQIDNo.6所示；
[0012]所述引物对4F/R中，F引物的序列SEQIDNo.7所示，R引物的序列如SEQIDNo.8所示；
[0013]所述引物对5F/R中，F引物的序列SEQIDNo.9所示，R引物的序列如SEQIDNo.10所示；
[0014]所述引物对6F/R中，F引物的序列SEQIDNo.11所示，R引物的序列如SEQIDNo.12所示；
[0015]所述引物对7F/R中，F引物的序列SEQIDNo.13所示，R引物的序列如SEQIDNo.14所示；
[0016]所述引物对8F/R中，F引物的序列SEQIDNo.15所示，R引物的序列如SEQIDNo.16所示；
[0017]所述引物对9F/R中，F引物的序列SEQIDNo.17所示，R引物的序列如SEQIDNo.18所示；
[0018]所述引物对10F/R中，F引物的序列SEQIDNo.19所示，R引物的序列如SEQIDNo.20所示；
[0019]所述引物对11F/R中，F引物的序列SEQIDNo.21所示，R引物的序列如SEQIDNo.22所示；
[0020]所述引物对12F/R中，F引物的序列SEQIDNo.23所示，R引物的序列如SEQIDNo.24所示；
[0021]所述引物对13F/R中，F引物的序列SEQIDNo.25所示，R引物的序列如SEQIDNo.26所示；
[0022]所述引物对14F/R中，F引物的序列SEQIDNo.27所示，R引物的序列如SEQIDNo.28所示；
[0023]所述引物对15F/R中，F引物的序列SEQIDNo.29所示，R引物的序列如SEQIDNo.30所示；
[0024]所述引物对16F/R中，F引物的序列SEQIDNo.31所示，R引物的序列如SEQIDNo.32所示；
[0025]所述引物对17F/R中，F引物的序列SEQIDNo.33所示，R引物的序列如SEQIDNo.34所示；
[0026]所述引物对18F/R中，F引物的序列SEQIDNo.35所示，R引物的序列如SEQIDNo.36所示；
[0027]所述引物对19F/R中，F引物的序列SEQIDNo.37所示，R引物的序列如SEQIDNo.38所示；
[0028]所述引物对20F/R中，F引物的序列SEQIDNo.39所示，R引物的序列如SEQIDNo.40所示；
[0029]所述引物对21F/R中，F引物的序列SEQIDNo.41所示，R引物的序列如SEQIDNo.42所示；所述引物对22F/R中，F引物的序列SEQIDNo.43所示，R引物的序列如SEQIDNo.44所示。
[0030]进一步的，引物对1F/R～22F/R由mSNP技术获得。
[0031]技术方案二：
[0032]一种根据上述的引物组检测西瓜种子纯度的混样检测方法，其包括如下步骤：
[0033]步骤1、选材：选取1个或多个西瓜品种；每份份西瓜样品至少采用96粒种子；
[0034]步骤2、对西瓜基因组DNA进行准确定量；
[0035]步骤3、将所述的引物组中进行引物合成，每个引物对中的正向引物和反向引物合成时，均合成10条带有不同目标标签的引物；然后按照指定的标签组合进行引物的混本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于mSNP技术的西瓜种子纯度检测用引物组，其特征在于，其包括引物对1F/R、引物对2F/R、引物对3F/R、引物对4F/R、引物对5F/R、引物对6F/R、引物对7F/R、引物对8F/R、引物对9F/R、引物对10F/R、引物对11F/R、引物对12F/R、引物对13F/R、引物对14F/R、引物对15F/R、引物对16F/R、引物对17F/R、引物对18F/R、引物对19F/R、引物对20F/R、引物对21F/R、引物对22F/R；其中每条引物对均由正向引物和反应引物组成；所述引物对1F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.1所示，R引物的序列如SEQ IDNo.2所示；所述引物对2F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.3所示，R引物的序列如SEQ IDNo.4所示；所述引物对3F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.5所示，R引物的序列如SEQ IDNo.6所示；所述引物对4F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.7所示，R引物的序列如SEQ IDNo.8所示；所述引物对5F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.9所示，R引物的序列如SEQ IDNo.10所示；所述引物对6F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.11所示，R引物的序列如SEQ IDNo.12所示；所述引物对7F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.13所示，R引物的序列如SEQ IDNo.14所示；所述引物对8F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.15所示，R引物的序列如SEQ IDNo.16所示；所述引物对9F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.17所示，R引物的序列如SEQ IDNo.18所示；所述引物对10F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.19所示，R引物的序列如SEQ IDNo.20所示；所述引物对11F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.21所示，R引物的序列如SEQ IDNo.22所示；所述引物对12F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.23所示，R引物的序列如SEQ IDNo.24所示；所述引物对13F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.25所示，R引物的序列如SEQ IDNo.26所示；所述引物对14F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.27所示，R引物的序列如SEQ IDNo.28所示；所述引物对15F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.29所示，R引物的序列如SEQ IDNo.30所示；所述引物对16F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.31所示，R引物的序列如SEQ IDNo.32所示；所述引物对17F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.33所示，R引物的序列如SEQ IDNo.34所示；所述引物对18F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.35所示，R引物的序列如SEQ IDNo.36所示；所述引物对19F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.37所示，R引物的序列如SEQ IDNo.38所示；所述引物对20F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.39所示，R引物的序列如SEQ IDNo.40所示；所述引物对21F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.41所示，R引物的序列如SEQ IDNo.42所示；所述引物对22F/R中，F引物的序列SEQ IDNo.43所示，R引物的序列如SEQ IDNo.44所
示。2.一种根据权利要求1所述的引物组检测西瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：步骤1、选材：选取1个或多个西瓜品种；每份西瓜样品至少采用96粒种子；步骤2、对西瓜基因组DNA进行准确定量；步骤3、将权利要求1中所述的引物组中进行引物合成，每个引物对中的正向引物和反向引物合成时，均合成10条带有不同目标标签的引物；然后按照指定的标签组合进行引物的混合制备引物混合液；步骤4、以西瓜基因组DNA为模板，用引物混合液分别对西瓜的基因组DNA进行一轮PCR扩增，获得目标区域；步骤5、将所获得的PCR扩增产物，进行等量混合；步骤6、混合后的产物进行片段筛选；步骤7、对筛选后所得体系中的单链DNA进行消化；步骤8、对消化后的产物进行纯化；步骤9、在步骤8中获得的体系中配置二轮PCR体系；步骤10、对二轮PCR产物进行纯化，完成测序文库的制备；步骤11、将测序文库等质量混合后上机测序，获得测序数据；步骤12、对获得的测试数据，再次根据标签组合将样本拆分开；步骤13、识别测试样目标位点的基因型结果，通过位点基因型情况判定种子的纯度。3.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝军会，许彦芬，高苗，李凝，刘景艺，张萌，刘田，龚舒，张丛，
申请(专利权)人：石家庄博瑞迪生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：