一种多抗筛选的杨树多基因遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种多抗筛选的杨树多基因遗传转化方法，属于植物基因工程技术领域。本发明专利技术通过将分别带有不同抗性的多种载体组合的农杆菌同时侵染杨树叶片，并通过多种抗生素(hygromycin B、G418 sulfate和bialaphos)特定浓度的组合筛选，得到对应的阳性杨树幼苗。本发明专利技术实施例阳性转化率在70％以上，其中pBI121、pCambia1305和pEarlygate103组合转化率达到97.72％，pCambia1305和pEarlygate103组合转化率达到97.01％。本发明专利技术建立的利用多种载体上带有的抗性基因对应的多种抗生素进行组合筛选的方法能够打破杨树遗传转化的单一载体依次转化的约束性，缩短了多基因转化的转化周期，提高转化效率。本发明专利技术实施例实现了6个基因的共同转化。个基因的共同转化。个基因的共同转化。

【技术实现步骤摘要】
一种多抗筛选的杨树多基因遗传转化方法


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种多抗筛选的杨树多基因遗传转化方法。

技术介绍

[0002]杨树(poplar)属杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus)植物，是世界上分布最广、适应性最强的树种，天然种约100多种。由于其生长速度快、基因组小等特点，杨树已经成为木本植物研究的模式材料。
[0003]随着分子生物学技术的发展和杨树分子设计育种的重大需求，对功能基因的研究越来越受到育种学家的重视。然而目前杨树遗传转化的周期长、效率低，且难以实现多个基因的共同转化，限制了杨树分子育种的发展。
[0004]前人报道的杨树遗传转化体系转化率可达到28％,但仍存在假阳性植株,其中假阳性植株所占比例高达到35％。[周熙莹.84K杨再生和遗传转化体系的研究[D].]东北林业大学,2013].近年来，随着遗传转化体系的不断优化，转化效率提高到53％。[王栋鑫.农杆菌介导烟草和毛白杨的遗传转化技术[D].河北农业大学,2018].
[0005]因此，如何提供一种周期本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多抗筛选的杨树多基因遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)侵染步骤：用含有携带不同抗性载体组合的农杆菌侵染液侵染带划痕的杨树叶片或切成条的杨树叶片10～15min，得到侵染叶片；其中所述携带不同抗性载体组合包括携带卡那霉素抗性的载体、携带潮霉素抗性的载体、携带双丙氨膦抗性的载体的任意组合；(2)遗传转化步骤：(21)侵染叶片倒置于共培养培养基上，黑暗环境下共培养1～3天，得到共培养叶片；(22)将带划痕的共培养叶片沿伤口撕开后放置在含有载体抗性对应的抗生素组合的筛选培养基上进行筛选培养，当愈伤组织生长至0.5～1.0cm，得到待分化愈伤组织；或将切成条的共培养叶片放置在含有载体抗性对应的抗生素组合的筛选培养基上进行筛选培养，当愈伤组织生长至0.5～1.0cm，得到待分化愈伤组织；(23)待分化愈伤组织在含有载体抗性对应的抗生素组合的分化培养基上进行分化培养，当不定芽生长至1.0～2.0cm，得到待生根不定芽；(24)待生根不定芽在含有载体抗性对应的抗生素组合的生根培养基上进行生根培养，得到生根幼苗；鉴定：对生根幼苗DNA所携带的载体抗性基因进行鉴定，鉴定引物包括：kan-F:GGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGA，SEQ ID NO.1；kan-R:GCTATGACTGGGCACAACAGACAAT，SEQ ID NO.2；hph-F:AAGGAATCGGTCAATACACTACATGG，SEQ ID NO.3；hph-R:AAGACCAATGCGGAGCATATACG，SEQ ID NO.4；bar-F:CCGTACCGAGCCGCAGGAAC，SEQ ID NO.5；bar-R:CAAATCTCGGTGACGGGCAGGAC，SEQ ID NO.6。2.如权利要求1所述的一种多抗筛选的杨树多基因遗传转化方法，其特征在于，所述载体抗性对应的抗生素组合包括hygromycin B+G418 sulfate、G418sulfate+bialaphos、hygromycin B+bialaphos和hygromycin B+G418 sulfate+bialaphos。...

【专利技术属性】
技术研发人员：付春祥，杨松，吴振映，曹英萍，刘文文，卢孟柱，周功克，
申请(专利权)人：青岛天韵生态科技有限公司，
类型：发明
国别省市：