用于鉴定黑果越橘的方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供鉴定植物组合物中的黑果越橘的方法和专门设计用于该方法实施的试剂盒。本发明专利技术的方法基于使用PCR扩增对黑果越橘基因组区域中的核酸片段的检测，其中所述基因组区域为内部转录间隔子1、5.8S核糖体RNA基因组区和内部转录间隔子2中的基因组区域。内部转录间隔子2中的基因组区域。内部转录间隔子2中的基因组区域。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于鉴定黑果越橘的方法和试剂盒


[0001]本专利技术提供了一种基于使用PCR扩增检测特定基因组片段用于鉴定植物组合物中的黑果越橘(Vaccinium myrtillus)的方法。本专利技术还提供了专门设计用于实施本专利技术方法的试剂盒。
[0002]专利技术背景
[0003]植物提取物广泛用于医疗、保健品、化妆品和食品工业。处理植物提取物时遇到的主要问题之一是不仅要确定其化学组成，还要确定其植物来源，以排除假冒风险。
[0004]用于确定植物材料的植物来源的基于遗传的方法是本领域已知的(Parker,T,et al,Field
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based species identification o fclosely
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related plants using real
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time nanopore sequencing.Sci Rep,2017.7(1):p.8345；Group,C.P.W.,A DNA barcode for land plants.Proc Natl Acad Sci U S A,2009.106(31):p.12794
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7；Fazekas,A.J.,et al.,DNA barcoding methods for land plants.Methods Mol Biol,2012.858:p.223)。此类方法基于植物材料中存在的DNA与公开可用数据库中存在的已知DNA序列的比较。例如，WO 2006/020147(The Regents of the University of California)公开了一种用于鉴定存在于植物混合物中的单独生物学遗传成分的方法，所述方法基于基因组座位特异性PCR、单链构象多态性(SSCP)和序列分析的组合。据称该方法能够提供关于组合物的生物成分的信息，而无需事先了解可能存在哪些植物，并能够检测和识别混合物中可能存在的未知生物成分。
[0005]从植物样品中遗传鉴定植物的方法也公开于CN102146477,CN106119394,CN1372005,CN107142329,CN107653330,CN105624291,CN105603107,ES2176066,CN104673930,CN102222969,CN102732513,CN105063203,JP2007282626。在一些情况下，用于鉴定植物物种的方法基于PCR扩增检测位于细胞核核糖体RNA编码基因座中包含内部转录间隔子(ITS)区域ITS
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1和/或ITS
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2的特定序列。在一些情况下(CN1052429、CN105603107、ES2176066)，这些方法旨在识别含有植物材料的商业产品中的掺假。
[0006]Jaakola L等人，Food Chemistry vol.123,no.2(2010)pp.494
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500，公开了通过DNA条形码和HRM(高分辨率熔解)分析的组合方式，使用能够对野生浆果进行物种特异性鉴定的设计引物对，鉴定商业上重要的浆果物种。黑果越橘使用引物ITSVm2f和ITSVm2r获得位于ITS(内部转录间隔子)区域中的扩增子，并对该扩增子进行HRM分析来鉴定。
[0007]CN108642207公开了越桔植物等位基因图谱的构建，以及利用引物特异性PCR扩增鉴定蓝莓品种和相关物种的方法。
[0008]Marieschi M.等人，Food Chemistry vol.202(2016)pp.438
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444公开了一种可用于多批次分析的、基于序列特征性扩增区域(SCAR)的方法，用于检测黑果越橘和掺假物种的存在。
[0009]Koskima Ki JJ等人，European Journal of Plant Pathology,Kluwer Academic Publishers
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vol.125no.4(2009)pp.629
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640公开，使用SYBR
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绿作为荧光报告分子，通过实时PCR定量越橘基因的相对表达。
[0010]在对植物材料加工，特别是进行提取操作时，DNA会降解，根据提取方法产生大小和数量不同的片段，这些片段无法直接与已知的DNA序列进行比较，因此即使不是实际上不可能，也难于将可用于起始材料的基因组鉴定方法应用于提取物。
[0011]黑果越橘提取物因其已知的有益健康的特性而广泛用于医药、化妆品、营养保健品和膳食产品。黑果越橘作为膳食补充剂和治疗剂的临床益处已经归因于大量黄酮类化合物和花青素类化合物的存在。对于提取物制造商而言，确保黑果越橘提取物在化学成分和声明的纯植物来源方面具有所需的规格，是非常重要的。因此，希望提供一种允许在植物组合物，例如植物提取物中鉴定黑果越橘的方法，从而特别是在黑果越橘与亲缘关系紧密的污染物种混合时，确保高水平的准确性和物种特异性。
[0012]专利技术详述
[0013]这些目的通过本专利技术得以实现，本专利技术提供了一种通过检测黑果越橘提取物残留DNA中包含的核酸片段来特异和准确地鉴定植物组合物中的黑果越橘的方法。
[0014]具体地，本专利技术的方法包括在植物组合物样品中检测黑果越橘特异性核酸片段，所述核酸片段位于内部转录间隔子1、5.8S核糖体RNA基因和内部转录间隔子2中，其中所述核酸片段由SEQ ID NO:1组成或由选自SEQ ID NO:2、3和4的包含SEQ ID NO:1的序列组成。
[0015]在一个优选实施方案中，用于PCR扩增的引物选自以下引物对：
[0016](i)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
[0017](ii)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；
[0018](iii)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
[0019](iv)SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。
[0020]在一个特别优选的实施方案中，PCR是实时PCR(rtPCR)并且本专利技术的方法包括以下步骤：
[0021](a)从植物组合物的样品中分离核酸；
[0022](b)在分离的核酸上进行rt
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PCR，其中使用：
[0023]‑
选自以下的引物对:
[0024](i)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
[0025](ii)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；
[0026](iii)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
[0027](iv)SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；
[0028]和
[0029]‑
在引物扩增的核酸区域内退火的探针，所述探针具有序列SEQ ID NO:13；
[0030](c)确定扩增产物的存在,
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种鉴定植物组合物中的黑果越橘的方法，包括通过PCR扩增从其样品检测黑果越橘核酸片段，所述核酸片段位于内部转录间隔子1、5.8S核糖体RNA基因组区和内部转录间隔子2中，所述方法包括以下步骤：(a)从所述样品中分离核酸；(b)在分离的核酸上进行实时PCR，其中使用：
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选自以下的引物组:(i)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；(ii)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；(iii)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；(iv)SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；和
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在引物扩增的核酸区域内退火的探针，所述探针由序列SEQ ID NO:13组成；(c)确定扩增产物的存在,其中，检测到扩增产物表明植物组合物中存在黑果越橘。2.权利要求1的方法，其中引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：V，
申请(专利权)人：因德纳有限公司，
类型：发明
国别省市：