一种蛋白纯化方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种蛋白纯化方法及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术设计了一种新型的内含肽，该内含肽含有两个部分，分别为连接聚集标签的N端(IN)和连接目的蛋白的C端(IC)，当两者混合之后，在适当的条件下发生切割反应，获得目的蛋白，而内含肽与聚集标签发生聚集反应，留在沉淀中，可通过离心去除。本发明专利技术的新型内含肽具有较高的切割效率，而且能够通过调节pH值控制切割率，实现在3个小时就可完成切割，并且当pH6.0时最高切割率达到98％；本发明专利技术将新型内含肽与聚集标签相结合，对目的蛋白具有更高的纯化效率，达到52～56％。达到52～56％。达到52～56％。

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白纯化方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种蛋白纯化方法及其应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]目前已有许多研究中尝试运用重组技术在工程菌中生产重组蛋白，然而，重组蛋白的纯化难度往往是实现其在临床及商业应用中的一大阻碍。在实验室范围内，许多亲和标签如His
‑
tag，几丁质结合蛋白(CBD)，麦芽糖结合蛋白(MBP)和谷胱甘肽转移酶(GST)等，由于它们的高特异性而得到了广泛的利用，发展成为成熟的亲和层析方法。虽然这些方法已被证实可以获得高浓度的重组蛋白，但树脂昂贵的价格使其在大规模纯化中的应用受到了阻碍。与此同时，亲和标签的存在可能会干扰目的蛋白的整体生化特性，因此我们有必要在下游流程中应用额外的步骤，以去除亲和标签，获得无氨基酸残留的天然蛋白。在这种复杂的情况下，基于内含肽的自裂解性质设计而成的非色谱纯化方法具备极大的应用潜力。
[0003]内含肽是一类具备自剪接特性的蛋白元件，它能够将自身从前体蛋白中移除并连接其侧翼序列(即外显肽)。在实际纯化应用中，通过突变关键残基，内含肽也可以在不剪接的情况下仅进行N端或C端切割反应。基于此，内含肽可以被遗传编码到重组蛋白序列中，根据需要提供标签的定点自切割。New England Biolabs Inc.(NEB)开发了第一批用于生物分离的内含肽，他们改造了来自酿酒酵母液泡ATP酶亚基的Sce VMA内含肽，将其插入亲和标签CBD与目的蛋白之间，使用硫醇试剂诱导完成N端切割反应(Brenzel,S.,Kurpiers,T.,and Mootz,H.D.(2006).Engineering artificially split inteins for applications in protein chemistry:Biochemical characterization of the split Ssp DnaB intein and comparison to the split Sce VMA intein.Biochemistry 45,1571
‑
1578.)，室温反应16h后切割效率超过95％，由此发展为商业化的IMPACT
TM
系统，之后又在此基础上加入了Mxe GyrA 内含肽和Ssp DnaB内含肽，扩展为IMPACT KIT
TM
(Lahiry,A.,Fan,Y.M.,Stimple,S.D.,Raith,M.,and Wood,D.W.(2018).Inteins as tools for tagless and traceless protein purification.J.Chem.Technol.Biotechnol.93,1827
‑
1835)。在之后的发展中，Xia等人(Xia,H.F.,Zhou,T.J.,Du,Y.X.,Wang,Y.J.,Shi,C.H.,and Wood,D.W.(2020).Improved protein purification system based on C
‑
terminal cleavage of Npu DnaE split intein.Bioprocess.Biosyst.Eng.,11.)将Npu DnaE内含肽与环氧活化的琼脂糖微球载体偶联，添加50mmol
·
L
‑1DTT诱导内含肽断裂，4h后反应基本完成，GFP回收率为37％。然而，在此类内含肽的应用中发现，内含肽在纯化过程中大多需要添加硫醇试剂，且回收率较低，造成了产物的部分损失；并且现有的纯化方法存在纯化周期长等缺点。

技术实现思路

[0004]为了解决现有内含肽纯化技术当中存在的纯化周期长，回收率低，且大多需要添加硫醇试剂等缺点，本专利技术设计了一种新型的内含肽，该内含肽含有两个部分，分别为连接聚集标签的N端(IN)和连接目的蛋白的C端(IC)，当两者混合之后，在适当的条件下发生切
割反应，获得目的蛋白，而内含肽与聚集标签发生聚集反应，留在沉淀中，可通过离心去除。
[0005]本专利技术提供了一种断裂内含肽，所述断裂内含肽包含N端内含肽IN和C端内含肽IC，所述N端内含肽IN的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述C端内含肽IC的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述N端内含肽IN的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述C端内含肽IC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0007]本专利技术还提供了一种亲和配基，所述亲和配基为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的N端内含肽IN与ELP蛋白进行融合，制备得到在ELP的N端融合N端内含肽的亲和配基IN
‑
ELP；所述ELP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0008]本专利技术还提供了一种蛋白纯化工具，所述纯化工具包括亲和配基、亲和标签；所述亲和配基为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的N端内含肽IN与ELP蛋白进行融合，制备得到在ELP的N端融合N端内含肽的亲和配基IN
‑
ELP；所述ELP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
[0009]所述亲和标签为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的C端内含肽作为亲和标签，将目的蛋白的N端与亲和标签连接。
[0010]本专利技术还提供了上述断裂内含肽在目的蛋白纯化中的应用。
[0011]本专利技术还提供了一种蛋白纯化方法，所述方法包括以下步骤：
[0012](1)将N端内含肽与ELP蛋白进行融合，制备得到在ELP的N端融合N端内含肽的亲和配基IN
‑
ELP；将C端内含肽作为亲和标签，与目的蛋白融合，制备得到N端融合了C端内含肽的IC
‑
目的蛋白；
[0013](2)将IC
‑
目的蛋白，与亲和配基IN
‑
ELP混合，使IN
‑
ELP结合IC
‑
目的蛋白，得到混合液；向混合液中添加氯化钠溶液进行孵育后离心取沉淀，将沉淀用pH 8.0
‑
10.0的结合缓冲液重悬后离心取上清液；将上清液与氯化钠溶液进行二次孵育后离心，收集沉淀；
[0014](3)将步骤(2)得到的沉淀采用切割缓冲液重悬后，在25
‑
37℃，并将切割缓冲液的pH调节至6.0～7.0的条件下进行反应后，添加氯化钠溶液进行孵育，孵育结束后离心，得到含有纯化后的目的蛋白的上清液；所述切割缓冲液为磷酸缓冲液。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中，是将纯化后的亲和配基IN
‑
ELP与IC
‑
目的蛋白进行混合，具体的纯化方法：
[0016]1)取含有IN
‑
ELP的上清液样品，在50mL离心管中加入相应体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种断裂内含肽，其特征在于，包含N端内含肽IN和C端内含肽IC，所述N端内含肽IN的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述C端内含IC的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.如权利要求1所述的断裂内含肽，其特征在于，编码所述N端内含肽IN的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述C端内含肽IC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.一种亲和配基，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的N端内含肽IN与ELP蛋白进行融合，制备得到在ELP的N端融合N端内含肽的亲和配基IN
‑
ELP；所述ELP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。4.一种蛋白纯化工具，其特征在于，所述纯化工具包括亲和配基、亲和标签；所述亲和配基为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的N端内含肽IN与ELP蛋白进行融合，制备得到在ELP的N端融合N端内含肽的亲和配基IN
‑
ELP；所述ELP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述亲和标签为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的C端内含肽作为亲和标签，将目的蛋白的N端与亲和标签连接。5.一种蛋白纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将N端内含肽与ELP蛋白进行融合，制备得到在ELP的N端融合N端内含肽的亲和配基IN
‑
ELP；将C端内含肽作为亲和标签，与目的蛋白融合，制备得到N端融合了C端内含肽的IC
‑
目的蛋白；(2)将IC
‑
目的蛋白，与亲和配基IN
‑
ELP混合，使IN
‑
ELP结合IC
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻晓蔚，徐岩，徐晓宇，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：