一种重组的变体FGF21蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种重组人成纤维细胞生长因子21类似物(mFGF21)及其制备方法。将重组mFGF21蛋白编码基因与表达载体连接得到重组质粒后转化宿主细胞，筛选阳性稳定表达工程菌进行高密度发酵，离心收集菌体进行高压匀浆破碎，经包涵体富集、洗涤、变性、复性和缓冲液置换工序，并采用离子交换层析进行精纯和膜分离技术的后处理，获得电泳及液相纯度大于98％的mFGF21蛋白。本发明专利技术还公开了重组mFGF21蛋白在治疗肥胖、糖尿病、高脂血症和非酒精性脂肪性肝病等代谢疾病上的应用。相较于野生型hFGF21，本发明专利技术mFGF21蛋白的稳定性和生物学活性明显提高，且在改善模型动物的血糖血脂水平及脂肪肝上的效果更显著。及脂肪肝上的效果更显著。

【技术实现步骤摘要】
一种重组的变体FGF21蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体讲是一种重组的变体FGF21蛋白及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]随着生活水平的不断提高，以糖尿病(DM)和非酒精性脂肪肝病(NASH)为代表的代谢类疾病成为威胁人类健康的隐形杀手。我国胰岛素抵抗型糖尿病患者(T2DM)超过1亿人，发病后期会产生失明、神经病变、高血压、肝肾脏病变和心血管疾病等并发症，2025年全球市场达到1200亿美金。脂肪肝已经成为被严重低估的重大健康威胁，患病人数已超过糖尿病(T2DM 1亿)，脂肪肝除了会引发肝脏严重病变乃至癌变之外，还可能引发心血管及代谢疾病，或者加快发病进程。国内约有近4.3亿的人群患有非酒精性脂肪肝，全球患病率高达25％，超过17.5亿人，2025年全球市场将达到400亿美金。
[0003]DM疾病如果不能得到有效控制，可引起体内多系统损害，导致眼、肾、神经、心脏、血管等组织的慢性进行性病变，引起功能缺陷乃至衰竭。糖尿病因其并发症多、致残率高的特点已成为现阶段全世界需要着力应对的公共卫生问题。目前临床上尚无治愈的方法，患者需要终身服药以维持血糖平稳。同样，NASH疾病如不治疗后期造成肝纤维化和肝癌的风险将明显增加，而在该疾病的治疗方面，目前尚无相关药物批准上市。
[0004]成纤维细胞生长因子(FGF21)是成纤维细胞生长因子家族的一名新成员，其氨基酸序列与有FGF19亚家族成员之间具有较高的同源性。大量实验表明FGF21是体内又一个可以独立调节血糖和血脂的调节因子，体外能够促进3T3
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L1脂肪细胞消耗葡萄糖，在体内具有降低血糖水平、降低甘油三酯、升高高密度胆固醇脂蛋白、降低低密度胆固醇脂蛋白等功能，并且不会产生低血糖、高胰岛素血症、体重增加及水肿等副作用。随着研究的进行，研究人员发现FGF
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21不仅在糖脂代谢上具有重要的调节作用，其功能还涉及改善胰岛β细胞机能，延缓化学诱导的肝癌产生，降低体重、减少脂肪堆积等方面。这些特征赋予了FGF21成为治疗糖脂代谢异常的代谢综合征新药的必备条件，作为安全可靠的代谢调节因子FGF21很有潜力成为改善胰岛素抵抗的新型药物。故FGF21在开发成治疗糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝等多种代谢疾病上具有重要的意义。但临床试验发现FGF21在糖尿病患者中并没有显著改善血糖的作用，这可能与设计的FGF21突变体的生物学活性和体内稳定性有关，所以对FGF21进行基因工程改造和化学修饰逐渐成为近年来研究的热点。

技术实现思路

[0005]鉴此，本专利技术通过计算机辅助预测及试验，设计并构建了变体mFGF21蛋白，通过优化表达及纯化工艺制备了具有稳定性和生物学活性较好的mFGF21蛋白。动物实验结果显示mFGF21蛋白在肥胖症、糖尿病及NASH模型小鼠上表现了良好的功效，且治疗效果显著优于野生型FGF21(hFGF21)。
[0006]本专利技术的目的是提供一种新的变体mFGF21蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所
示；或与上述序列同源性高(例如至少95％、至少98％、至少99％同源性或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失和/或添加的序列)；或包含至少一个在第56位或第59位或第69位或第122位的氨基酸突变，其中第56位的氨基酸突变选自如下任意一个氨基酸突变：K56R；K56A；K56H；K56G；K56L；K56I，第59位的氨基酸突变选自如下任意一个：K59R；K59A；K59H；K59L；K59I，第69位的氨基酸突变选自如下任意一个氨基酸突变：K69R；K69A；K69H；K69L；K69I，第122位的氨基酸突变选自如下任意一个氨基酸突变：K122R；K122A；K122H；K122L；K122I。
[0007]本专利技术的另一目的是提供编码所述mFGF21蛋白的DNA序列及含该DNA序列的载体，还包括含该载体的宿主细胞。
[0008]进一步地，所述的变体mFGF21蛋白的制备方法，包括如下步骤：
[0009]步骤一：携带目的蛋白基因表达载体的构建：将合成的序列表中SEQ ID NO:1的基因片段与原核表达载体连接，转化大肠杆菌，获得表达菌种。
[0010]步骤二：mFGF21蛋白的表达：培养重组表达菌种并诱导其生产目标蛋白；
[0011]步骤三：mFGF21蛋白的纯化：收获经步骤二处理的表达菌种，经破碎、离心、膜分离、离子交换层析和超滤等工序，最终获得高纯度的目标蛋白。
[0012]进一步地，本专利技术还提供一种治疗代谢类疾病的含有上述mFGF21蛋白的药物组合物，可用于治疗糖尿病、肥胖症及非酒精性脂肪肝或相关疾病包括降低肝脏重量和肝脏甘油三酯的含量、修复肝脏损伤，改善非酒精性脂肪性肝炎、肝损伤、肝硬化等相关的代谢综合征。
[0013]再一方面，本专利技术还提供所述药物组合物在制备预防或治疗代谢类疾病药物中的用途。
[0014]进一步地，本专利技术还公开了一种修饰产物，采用药学上可接受的化学修饰物对mFGF21蛋白进行修饰而得，化学修饰物选自以下的一种或多种：聚合物(例如聚乙二醇(PEG)，羟乙基淀粉(HES)，透明质酸，聚唾液酸)，非结构化(多)肽链(例如PAS，XTEN)，类弹性蛋白样多肽(ELP)，血清蛋白(例如白蛋白)，血清蛋白结合分子(例如白蛋白结合域(ABD)，白蛋白结合脂肪酸)，抗体，免疫球蛋白，免疫球蛋白的Fc区/域和免疫球蛋白结合域。
[0015]本专利技术的变体FGF21蛋白的制备优选大肠杆菌表达系统，结合膜分离和色谱层析技术，发展了一种具有高表达、高产率、低成本的整体纯化工艺，可稳定高效制备高纯度的目标蛋白。
[0016]本专利技术的有益效果：
[0017](1)本专利技术的变体FGF21蛋白相比野生型hFGF21具有更长效、更稳定、更好的治疗胖症，糖尿病，高血糖症，血脂异常，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、动脉粥样硬化、肝损伤、肝硬化、肝癌等代谢疾病的功效。
[0018](2)本专利技术提供了一种高效稳定的FGF21蛋白的整体纯化方法。相对于真核表达系统(表达量约在30
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70mg/L)，本专利技术采用大肠杆菌体系及适配的表达载体可获得较高的表达量，这样将显著降低了生产成本；并且集成膜分离和色谱分离技术开发的整体纯化工艺简便和收率高，该方法具有稳定、易于线性方法和高产量等优势，为后期蛋白药物的工业化研究奠定了坚实的基础。
Microbiol Biotechnol.2019；103(2):719
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730.)。而本专利大肠杆菌高密度发酵体系达产量达400mg/L。因此，可说明，采用大肠杆菌体系可获得较高的表达量。泳道M：蛋白标准分子量Marker；YQ：诱导前菌体；QJ：诱导后全菌；SQ：菌体破碎离心上清；CD：菌体破碎离心沉淀。
[0036](3)FGF21蛋白的纯化
[0037]通过管式离心机收集高密度发酵表达菌体，并采用洗涤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组的变体mFGF21蛋白，其特征在于，其氨基酸序列：如SEQ ID NO:2所示；或与SEQ ID NO:2序列至少具有95％的同源性；或包含在SEQ ID NO:2序列上的以下一个或多个位置处的氨基酸突变：第56位、第59位、第69位、第122位。2.根据权利要求1所述的一种重组的变体mFGF21蛋白，其特征在于，所述第56位的氨基酸突变选自如下任意一个氨基酸突变：K56R，K56A，K56H，K56G，K56L，K56I；所述第59位的氨基酸突变选自如下任意一个氨基酸突变：K59R，K59A，K59H，K59L，K59I；第69位的氨基酸突变选自如下任意一个氨基酸突变：K69R，K69A，K69H，K69L，K69I；第122位的氨基酸突变选自如下任意一个氨基酸突变：K122R，K122A，K122H，K122L，K122I。3.一种如权利要求1所述的变体mFGF21蛋白的编码基因，其特征在于,其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。4.携带如权利要求3所述编码基因的载体或宿主细胞。5.一种重组的变体mFGF21蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，叶贤龙，郭志谋，胡飞，
申请(专利权)人：赣江中药创新中心，
类型：发明
国别省市：