一种抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法技术

本发明专利技术公开了一种抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，属于甘蓝育种技术领域。该方法选择综合性状优良的甘蓝CMS不育系/保持系分别与综合性状优良的甘蓝可育株杂交，再分别从其杂交后代中采用离体组织培养，重组筛选球形相近、熟期相近、颜色相近综合性状优良的不育株与相近的可育株回交3代，可育株自交一代后株间交，培育出新的不同熟性，球形，颜色综合性状优良的CMS不育系/保持系，以及其它新的优良可育株。通过愈伤组织原生质体改良培养，提高原生质体再生植株发生频率，剔除嵌合体，多倍体，保留优良的可育株，创制更多更好的新种质资源。资源。

【技术实现步骤摘要】
一种抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法


[0001]本专利技术属于甘蓝育种
，具体涉及一种抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法。

技术介绍

[0002]结球甘蓝(Brassica oleacea L.var.capitata L.)是十字花科芸薹属植物的一个变种，又名卷心菜、包菜等，起源于地中海沿岸，性喜温和气候，是中国主要的蔬菜作物之一，16世纪开始传入中国。结球甘蓝(以下简称甘蓝)具有抗病、适应性强、易贮耐运、产量高、品质好等特点，在我国各地普遍栽培，发展很快，是我国东北、西北、华北等地区春、夏、秋冬季的主要蔬菜之一，每年种植面积300万hm2以上，在蔬菜周年供应及出口贸易中都占有重要地位。
[0003]目前国内甘蓝种子仍需从国外进口，种子价格昂贵，由于甘蓝有较强的杂种优势，生产上主要利用自交不亲和系和细胞质雄性不育系(CMS不育系)配制杂交种。但利用自交不亲和系制种要花费大量的人力和时间进行亲本繁殖(通过人工蕾期授粉)，成本很高，推广面积受制种量制约。更不利的是亲本长期连续自交易生活力退化，使一些优良的性状丢失，杂交率很难达到100％，而利用细胞质雄性不育系(CMS不育系)配制甘蓝优良品种时杂交率达到100％，不需要恢复系，只需要父本系。
[0004]甘蓝优良品种是提高农产品产量、改善品质、提高市场竞争力的基础。创制种质资源是培育优良新品种基础中的基础。随着基因组学和生物信息学的迅猛发展，正在促使植物育种方法发生重大变革。通过甘蓝的真叶、胚轴及愈伤组织等原生质体培养创造具有重大应用价值的种质资源，培育高产优质多抗高效甘蓝新品种，对打破外国垄断，推广自主知识产权品种，确保我国粮食安全、生态安全和促进农民增收具有重大战略意义。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的问题，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，通过愈伤组织原生质体改良培养，提高原生质体再生植株发生频率，剔除嵌合体，多倍体，保留优良的可育株，创制更多更好的新种质资源。
[0006]为了解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0007]一种抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，综合性状优良的甘蓝CMS不育系/保持系分别与综合性状优良的甘蓝可育株杂交，再分别从其杂交后代中采用离体组织培养，重组筛选球形相近、熟期相近、颜色相近综合性状优良的不育株与相近的可育株回交3代，可育株自交一代后株间交，培育出新的不同熟性，球形，颜色综合性状优良的CMS不育系/保持系，以及其它新的优良可育株。具体包括以下步骤：
[0008](1)愈伤组织培养
[0009]通过综合性状优良的甘蓝成对CMS不育系/保持系单株与综合性状优良的甘蓝可育株杂交，分别得到CMS不育系F1/保持系F1；选择CMS不育系F1后代和保持系F1后代优良单
株的叶球剖面进行愈伤组织培养，得到锥形愈伤组织；CMS不育系和可育系愈伤组织培养，方法同上，分开培养；
[0010](2)增殖培养
[0011]将锥形愈伤组织消毒处理后切取15
‑
20g，横切成0.5～1.5mm长的切片，先后进行质壁分离和酶解处理；酶解完成后，将原生质体酶混合液经70
‑
80μm尼龙膜过滤，除去酶解杂质，以1200r/min的离心速度离心4min收集原生质体；收集的原生质体以不同梯度浓度的蔗糖液漂浮并离心，根据原生质体层所处的位置挑选漂浮液适宜的蔗糖浓度，收集原生质体条带；纯化后的原生质体以血球计数板统计产量，以台盼蓝染色测定原生质体活力，以去壁彻底的原生质体频率计算“完全去壁率”；其中原生质体呈球形，质膜薄而光滑的计为去壁彻底者； CMS不育系和可育系叶球剖面诱导的锥形愈伤组织增殖培养，方法同上，分开培养；
[0012](3)原生质体培养
[0013]将纯净的原生质体密度调节为每毫升1.5
×
105个，并用原生质体培养基对原生质体进行液体浅层培养；原生质体培养12d后，每隔5d向每培养皿分别加入400μl渗透压降压培养基，培养到第5周，开始有肉眼可见的微愈伤出现，将培养皿移入弱光下生长；微愈伤增长至一定数量时，陆续将其从液体培养基中移至增殖培养基中；CMS不育系和可育系原生质体培养，方法同上，分开处理；
[0014](4)芽的诱导
[0015]将转绿的愈伤颗粒转移到芽分化培养基中进行诱导芽的分化；CMS不育系和可育系愈伤颗粒培育，方法同上，分开处理；
[0016](5)根的诱导
[0017]取生长状态良好的再生绿芽，按照每瓶接种3
‑
4个的接种量接种于体积为60
‑
70ml生根培养基上进行生根培养；CMS不育系和可育系再生绿芽培育，方法同上，分开培养；
[0018](6)再生苗的移植
[0019]2周后生根，获得完整的再生植株；再生植株经驯化炼苗后移入营养钵中，置于温室中炼苗，炼苗条件为:温度20
‑
25℃，3天后将组培瓶的瓶塞打开，7天后取出，洗去根部琼脂，将其栽植于培养介质中，湿度为80％
‑
90％，温度20℃
‑
23℃，20天后定植移栽到大花钵中让其充分生长；CMS不育系和可育系再生苗培育方法同上，分开移植；
[0020](7)再生植株倍性检测
[0021]剔除嵌合体，多倍体，只保留优良的植株；CMS不育系和可育系再生植株，倍性检测方法同上，分开检测；
[0022]CMS不育系和可育系相近植株筛选原则：对优良的CMS不育系和可育系再生植株根据株型，子叶颜色，下胚轴颜色，外叶颜色，外叶形状，叶球形状，叶球颜色、叶球熟性较近的CMS不育系和可育系植株1:1配对，不育株作母本，可育株作父本，成对回交3代，不育株作CMS不育系，可育株自交1代后株间交保存作保持系，从而形成N组新CMS不育系和保持系。
[0023]所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，选择CMS不育系F1后代和保持系F1后代优良单株，叶球紧实时，切割叶球，切口平，再沿叶球顶部中心位置竖切，呈1/2半球状，叶球、切口处洗净，先用质量百分比为70％的酒精浸泡30s，再用0.1％HgCl2消毒1min，然后无菌水冲洗3
‑
4次，得到消毒后的叶球剖面，用于愈伤组织培养。
[0024]所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，MS培养基，以1L计，组成为：NH4HO
3 1650mg，KNO
3 1900mg，CaCl2·
2H2O 440mg，KH2PO
4 170mg，MgSO4·
7H2O 370mg，FeSO4·
7H2O 27.8mg，Na2EDTA 37.3mg，H3BO
3 6.2mg，MnSO4·
H2O 16.9mg，ZnSO4·
7H2O 8.6mg， Na2MoO4·
2H2O 0.25mg，CuSO4·
5H2O 0.025本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，其特征在于，选择综合性状优良的甘蓝CMS不育系/保持系分别与综合性状优良的甘蓝可育株杂交，再分别从其杂交后代中采用离体组织培养，重组筛选球形相近、熟期相近、颜色相近综合性状优良的不育株与相近的可育株回交3代，可育株自交一代后株间交，培育出新的不同熟性，球形，颜色综合性状优良的CMS不育系/保持系，以及其它新的优良可育株。2.根据权利要求1所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)愈伤组织培养通过综合性状优良的甘蓝成对CMS不育系/保持系单株与综合性状优良的甘蓝可育株杂交，分别得到CMS不育系F1/保持系F1；选择CMS不育系F1后代和保持系F1后代优良单株的叶球剖面进行愈伤组织培养，得到锥形愈伤组织；CMS不育系和可育系愈伤组织培养，方法同上，分开培养；(2)增殖培养将锥形愈伤组织消毒处理后切取15
‑
20g，横切成0.5～1.5mm长的切片，先后进行质壁分离和酶解处理；酶解完成后，将原生质体酶混合液经70
‑
80μm尼龙膜过滤，除去酶解杂质，以1200r/min的离心速度离心4min收集原生质体；收集的原生质体以不同梯度浓度的蔗糖液漂浮并离心，根据原生质体层所处的位置挑选漂浮液适宜的蔗糖浓度，收集原生质体条带；纯化后的原生质体以血球计数板统计产量，以台盼蓝染色测定原生质体活力，以去壁彻底的原生质体频率计算“完全去壁率”；其中原生质体呈球形，质膜薄而光滑的计为去壁彻底者；CMS不育系和可育系叶球剖面诱导的锥形愈伤组织增殖培养，方法同上，分开培养；(3)原生质体培养将纯净的原生质体密度调节为每毫升1.5
×
105个，并用原生质体培养基对原生质体进行液体浅层培养；原生质体培养12d后，每隔5d向每培养皿分别加入400μl渗透压降压培养基，培养到第5周，开始有肉眼可见的微愈伤出现，将培养皿移入弱光下生长；微愈伤增长至一定数量时，陆续将其从液体培养基中移至增殖培养基中；CMS不育系和可育系原生质体培养，方法同上，分开处理；(4)芽的诱导将转绿的愈伤颗粒转移到芽分化培养基中进行诱导芽的分化；CMS不育系和可育系愈伤颗粒培育，方法同上，分开处理；(5)根的诱导取生长状态良好的再生绿芽，按照每瓶接种3
‑
4个的接种量接种于体积为60
‑
70ml生根培养基上进行生根培养；CMS不育系和可育系再生绿芽培育，方法同上，分开培养；(6)再生苗的移植2周后生根，获得完整的再生植株；再生植株经驯化炼苗后移入营养钵中，置于温室中炼苗，炼苗条件为:温度20
‑
25℃，3天后将组培瓶的瓶塞打开，7天后取出，洗去根部琼脂，将其栽植于培养介质中，湿度为80％
‑
90％，温度20℃
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23℃，20天后定植移栽到大花钵中让其充分生长；CMS不育系和可育系再生苗培育方法同上，分开移植；(7)再生植株倍性检测剔除嵌合体，多倍体，只保留优良的植株；CMS不育系和可育系再生植株，倍性检测方法
同上，分开检测；CMS不育系和可育系相近植株筛选原则：对优良的CMS不育系和可育系再生植株根据株型，子叶颜色，下胚轴颜色，外叶颜色，外叶形状，叶球形状，叶球颜色、叶球熟性较近的CMS不育系和可育系植株1:1配对，不育株作母本，可育株作父本，成对回交3代，不育株作CMS不育系，可育株自交1代后株间交保存作保持系，从而形成N组新CMS不育系和保持系。3.根据权利要求2所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，其特征在于，选择CMS不育系F1后代和保持系F1后代优良单株，叶球紧实时，切割叶球，切口平，再沿叶球顶部中心位置竖切，呈1/2半球状，叶球、切口处洗净，先用质量百分比为70％的酒精浸泡30s，再用0.1％HgCl2消毒1min，然后无菌水冲洗3
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4次，得到消毒后的叶球剖面，用于愈伤组织培养。4.根据权利要求2所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，其特征在于，MS培养基，以1L计，组成为：NH4HO
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【专利技术属性】
技术研发人员：山溪，戴忠良，秦文斌，
申请(专利权)人：江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，
类型：发明
国别省市：