使用酶促消化来富集信息性DNA片段的文库制备方法技术

本公开内容提供了用于制备核酸文库的方法和组合物。在一些实施方案中，核酸包含需要分析(例如通过测序)的无细胞DNA，包括cfDNA。所述方法可包括限制酶消化、衔接子连接和后续扩增，并且可提供用于在所述方法期间降低所产生的衔接子二聚体数目的改进方法。在一个方面中，用于制备核酸文库的方法可包括：用限制酶消化DNA分子以产生DNA片段；通过与连接酶一起孵育来将衔接子与DNA片段连接，以产生经衔接子连接的DNA片段和衔接子二聚体的混合物；扩增经衔接子连接的DNA片段以产生扩增的经衔接子连接的DNA片段；以及通过区分衔接子与DNA片段之间的连接和衔接子与另一衔接子之间的连接来降低衔接子二聚体的数量。接来降低衔接子二聚体的数量。接来降低衔接子二聚体的数量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用酶促消化来富集信息性DNA片段的文库制备方法
[0001]交叉引用
[0002]本申请要求于2019年4月28日提交的美国临时专利申请No.62/839,719的权益，其通过引用整体并入本文。


[0003]本公开内容的一些实施方案至少包括核酸制备和分析、测序、分子生物学、细胞生物学和医学的领域。

技术介绍

[0004]随着下一代测序(next generation sequencing，NGS)技术的快速发展，对脱氧核糖核酸(DNA)中基因组改变的分析已成为提供关于疾病(例如癌症)或其他健康(例如母体血液中的胎儿遗传物质)状态的诊断信息的常规分析。典型的测序文库制备技术可包括一种或更多种操作，例如DNA片段化、片段的末端修复、dA加尾、衔接子连接和聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)富集，以及一个或更多个纯化步骤。
[0005]某些健康病症例如癌症或感染性疾病可导致DNA释放到血流或淋巴系统中，其中肿瘤DNA或微生物组DNA可成为体液例如血浆或尿中的循环无细胞DNA(cell
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free DNA，cfDNA)的一部分。可使这样的cfDNA进行基因组或表观基因组学谱分析以用于临床应用，例如癌症筛选、微生物检测或产前测试。例如，全基因组亚硫酸氢盐测序(whole
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genome bisulfite sequencing，WGBS)可提供DNA甲基化组的全面视图，但对整个基因组进行深度测序可能是昂贵的。富集无细胞DNA的信息性区域的方法可有利地允许针对临床诊断应用进行基因组或表观基因组学谱分析。使用限制酶、成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)、转座酶或其他技术可以以可通过尺寸选择来富集信息性片段的方式将完整DNA片段化。例如，MspI酶消化可通过产生可用于甲基化谱分析的较小片段来富集富CpG区域。
[0006]无细胞DNA的可在约166个碱基对(base pair，bp)处表现出特征峰的片段化性质对典型的基于限制酶消化的富集方法提出了挑战。选择信息性DNA的任何尺寸选择方法均可选择所有或几乎所有的cfDNA群并因此导致低富集。
[0007]本公开内容提供了对用于核酸文库制备的方法和组合物的改进。
[0008]专利技术概述
[0009]本公开内容提供了使用限制酶和衔接子制备核酸文库的方法，其中这样的制备方法代表了技术上的改进。在一些实施方案中，该方法包括具有降低的衔接子二聚体水平的文库制备。一旦制备，核酸文库就可用于任何目的，例如包括用于下一代测序。在一些实施方案中，本公开内容涉及从信息性脱氧核糖核酸(DNA)片段制备文库的方法，所述DNA片段的序列、修饰状态和/或水平指示医学病症或其风险或其易感性。本文中使用的“信息性片段”是指通过用限制酶进行切割而产生的片段(例如，在MspI限制酶消化之后的多个CpG位点)。核酸可以是任何种类，但在一些实施方案中，核酸包含DNA，包括无细胞DNA(cfDNA)。在
一些实施方案中，文库用于cfDNA的甲基化谱分析。
[0010]在一个方面中，本公开内容提供了用于制备(例如，来自对象的多种脱氧核糖核酸(DNA)分子的)核酸的文库(例如，出于分析包括通过测序的目的)的方法，其包括：使多个DNA分子发生酶促消化以将所述DNA分子的至少一个子集片段化以产生在一个或两个末端具有突出端的DNA片段；将衔接子与与DNA片段的突出端互补的突出端连接以产生多个经标记的DNA分子；在降低衔接子二聚体的数目之前或之后富集多个经标记的DNA分子(其在本文中可称为经衔接子连接的DNA分子或片段)；以及任选地使多个经标记的DNA分子或其衍生物进行核酸测序以产生多个序列读出。
[0011]在一些实施方案中，在连接衔接子期间和/或之后，使用限制酶例如BspDI、ClaI、AclI、NarI、Xhol、SmlI、HpyF30I、PaeR71、Sfr274I或其组合来消化衔接子二聚体。在一些实施方案中，使用以下在同一反应中进行发生和连接步骤：(1)一种或更多种限制酶，例如MspI和/或HpaII和/或Taqα1，以及(2)连接酶，例如T7和/或T4连接酶。在一些实施方案中，使用以下在同一反应中进行发生、连接和降低步骤：(1)一种或更多种限制酶，例如MspI和/或HpaII、和/或TaqαI、和/或BspD1、和/或ClaI、和/或AclI、和/或NarI、和/或XhoI、和/或SmlI、和/或HpyF30I、和/或PaeR7I、和/或Sfr274I，以及(2)连接酶，例如T7和/或T4连接酶。在一些实施方案中，多个经标记DNA的富集包括扩增步骤，例如用聚合酶链反应(PCR)进行的扩增步骤。在一些实施方案中，多个经标记DNA的富集包括靶向捕获。在一些实施方案中，多个经标记DNA发生亚硫酸氢盐转化。在一些实施方案中，用于PCR的引物被设计为识别衔接子与靶DNA之间的连接，但不识别衔接子与衔接子之间的连接。
[0012]在一个方面中，本公开内容提供了用于从对象的多个cfDNA分子中富集多个DNA片段的方法，其包括：使多个cfDNA分子发生酶促消化以将cfDNA分子的至少一个子集片段化以产生包含一个或更多个目的区域的片段；将衔接子与与多个片段化cfDNA分子的突出端互补的突出端连接以提供多个经标记的DNA分子；降低衔接子二聚体的数目；任选地使多个经标记的DNA分子或其衍生物进行核酸测序以产生多个序列读出；以及处理多个序列读出以提供一种或更多种临床应用。
[0013]在另一个方面中，本公开内容提供了用于制备核酸文库的方法，其包括：(a)提供多个DNA分子；(b)用第一一种或更多种限制酶使所述分子发生消化，其中所述发生产生了DNA片段；(c)使DNA片段经受(例如，连接)衔接子，其中所述经受产生了经衔接子连接的DNA片段和衔接子二聚体的混合物；以及(d)扩增经衔接子连接的DNA片段以产生扩增的经衔接子连接的DNA片段，其中任选地在一些实施方案中该方法还包括以相同操作进行(b)和(c)，其中该方法还包括降低所产生的衔接子二聚体，其中该降低在(c)期间或之后和/或在(d)之后进行，其中该降低包括区分衔接子与DNA片段之间的连接和衔接子与另一衔接子之间的连接。
[0014]在另一个方面中，本公开内容提供了用于制备核酸文库的方法，其包括：(a)提供多个DNA分子；(b)用第一一种或更多种限制酶使所述分子发生消化，其中所述发生产生了DNA片段；(c)使DNA片段经受(例如，连接)衔接子，其中所述经受产生了经衔接子连接的DNA片段和衔接子二聚体的混合物；以及(d)扩增经衔接子连接的DNA片段以产生扩增的经衔接子连接的DNA片段，进行以下中的一项或更多项：(1)使用结合DNA片段的末端与衔接子之间的连接但不结合一个衔接子的末端与另一衔接子的末端之间的连接的引物进行(d)；(2)使...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于制备核酸文库的方法，其包括：(a)用第一一种或更多种限制酶消化多个DNA分子以产生DNA片段；(b)通过与连接酶一起孵育来将衔接子与所述DNA片段连接以产生经衔接子连接的DNA片段和衔接子二聚体的混合物；(c)扩增所述经衔接子连接的DNA片段以产生扩增的经衔接子连接的DNA片段；以及(d)在(b)之后或期间和/或在(c)之后降低所述衔接子二聚体的数量，其中所述降低包括区分衔接子与DNA片段之间的连接和衔接子与另一衔接子之间的连接。2.权利要求1所述的方法，其中所述第一一种或更多种限制酶包含：AcII，HindIII，MluCI，PciI，AgeI，BspMI，BfuAI，SexAI，MluI，BceAI，HpyCH4IV，HpyCH4III，BaeI，BsaXI，AflIII，SpeI，BsrI，BmrI，BglII，BspDI，PI
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SceI，NsiI，AseI，CspCI，MfeI，BssS
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I，DraIII，EcoP15I，AlwNI，BtsIMutI，NdeI，CviAII，FatI，NlaIIＩ，FspEI，XcmI，BstXI，PflMI，BccI，NcoI，BseYI，FauI，TspMI，XmaI，LpnPI，AclI，ClaI，SacII，HpaII，MspI，ScrFI，StyD4I，BsaJI，BslI，BtgI，NciI，AvrII，MnlI，BbvCI，SbfI，Bpul0I，Bsu36I，EcoNI，HpyAV，BstNI，PspGI，StyI，BcgI，PvuI，EagI，RsrII，BsiEI，BsiWI，BsmBI，Hpy99I，AbaSI，MspJI，SgrAI，BfaI，BspCNI，XhoI，PaeR7I，EarI，AcuI，PstI，BpmI，DdeI，SfcI，AflII，BpuEI，SmlI，AvaI，BsoBI，MboII，BbsI，BsmI，EcoRI，HgaI，AatII，PflFI，Tth111I，AhdI，DrdI，SacI，BseRI，PleI，HinfI，Sau3AI，MboI，DpnII，TfiI，BsrDI，BbvI，Bts
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I，BstAPI，SfaNI，SphI，NmeAIII，NgoMIV，BglI，AsiSI，BtgZI，HhaI，HinP1I，BssHII，NotI，Fnu4HI，MwoI，BmtI，NheI，BspQI，BlpI，TseI，ApeKI，Bsp1286I，AlwI，BamHI，BtsCI，FokI，FseI，SfiI，NarI，PluTI，KasI，AscI，EciI，BsmFI，ApaI，PspOMI，Sau96I，KpnI，Acc65I，BsaI，HphI，BstEII，AvaＩI，BanI，BaeGI，BsaHI，BanII，CviQI，BciVI，SalI，BcoDI，BsmAI，ApaLI，BsgI，AccI，Tsp45I，BsiHKAI，TspRI，ApoI，NspI，BsrF
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I，BstYI，HaeII，EcoO109I，PpuMI，I
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CeuI，I
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SceI，BspHI，BspEI，MmeI，Taq
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I，Hpy188I，Hpy188III，XbaI，BclI，PI
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PspI，BsrGI，MseI，PacI，BstBI，PspXI，BsaWI，EaeI，HpyF30I，Sfr274I，或其组合。3.权利要求1或2所述的方法，其还包括在同一反应混合物中进行(a)和(b)。4.权利要求3所述的方法，其中(a)在与(b)不同的温度下进行。5.权利要求3所述的方法，其中(a)在与(b)相同的温度下进行。6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中区分衔接子与DNA片段之间的连接和衔接子与另一衔接子之间的连接还包括使用这样的衔接子：其被设计为在处于二聚化构型时被第二一种或更多种限制酶消化，但是当所述衔接子与所述DNA片段的末端连接时，其不能被所述第二一种或更多种限制酶消化。7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中(d)包括在所述扩增期间使用能够在所述衔接子与DNA片段之间的连接处引发聚合但不能在所述衔接子与另一衔接子之间的连接处引发聚合的引物。8.用于制备核酸文库的方法，其包括：(a)用第一一种或更多种限制酶消化多个DNA分子以产生DNA片段；(b)通过与连接酶一起孵育来将衔接子与所述DNA片段连接以产生经衔接子连接的DNA片段和衔接子二聚体的混合物；以及
(c)扩增所述经衔接子连接的DNA片段以产生扩增的经衔接子连接的DNA片段，进行以下中的一项或更多项：(1)使用结合所述DNA片段的末端与所述衔接子之间的连接但不结合一个衔接子的末端与另一衔接子的末端之间的连接的一种或更多种引物进行(c)；(2)用第二一种或更多种限制酶消化所述经衔接子连接的DNA片段和衔接子二聚体的混合物，所述第二一种或更多种限制酶消化一个衔接子的末端与另一衔接子的末端之间的连接，但不消化所述DNA片段的末端与所述衔接子之间的连接；(3)在同一反应混合物中进行(a)和(b)，以及还包括用第二一种或更多种限制酶消化所述混合物，所述第二一种或更多种限制酶消化一个衔接子的末端与另一衔接子的末端之间的连接，但不消化所述DNA片段的末端与所述衔接子之间的连接；(4)所述衔接子是经设计的衔接子二聚体，以及还包括用第二一种或更多种限制酶消化所述经衔接子连接的DNA片段和衔接子二聚体的混合物，所述第二一种或更多种限制酶消化一个衔接子的末端与另一衔接子的末端之间的连接，但不消化所述DNA片段的末端与所述衔接子之间的连接；和/或(5)(c)产生扩增的衔接子二聚体，其用第三一种或更多种限制酶消化，所述第三一种或更多种限制酶消化一个衔接子的末端与另一衔接子的末端之间的连接。9.权利要求8所述的方法，其还包括区分所述经衔接子连接的片段中的甲基化核酸碱基和非甲基化核酸碱基。10.权利要求9所述的方法，其还包括使所述经衔接子连接的片段发生亚硫酸氢盐转化。11.权利要求9或10所述的方法，其还包括使所述经衔接子连接的片段发生一个或更多个酶促和/或化学反应。12.权利要求11所述的方法，其还包括使甲基化胞嘧啶核酸碱基和/或羟甲基化胞嘧啶核酸碱基氧化以产生氧化反应产物，随后使所述氧化反应产物还原和/或脱氨基。13.权利要求12所述的方法，其中所述氧化用十
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十一易位(TET)酶进行。14.权利要求12所述的方法，其中所述氧化用高钌酸钾进行。15.权利要求12所述的方法，其中氧化反应产物的脱氨基用载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样物质(APOBEC)进行。16.权利要求12所述的方法，其中氧化反应产物的还原和/或脱氨基用吡啶硼烷进行。17.权利要求11至16中任一项所述的方法，其还包括在所述一个或更多个酶促和/或化学反应之前进行β
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葡糖基转移酶处理。18.权利要求8至17中任一项所述的方法，其中对所述扩增的经衔接子连接的DNA片段的部分或全部进行分析、修饰或进行二者。19.权利要求18所述的方法，其中所述分析包括测序。20.权利要求19所述的方法，其中所述测序是下一代测序。21.权利要求20所述的方法，其还包括在所述下一代测序之前进行靶向捕获以进一步富集经衔接子连接的片段。22.权利要求20或21所述的方法，其还包括在所述下一代测序之前进行尺寸选择以进一步富集经衔接子连接的片段。
23.权利要求18至22中任一项所述的方法，其还包括分析所述扩增的经衔接子连接的DNA片段以产生甲基化谱。24.权利要求8至23中任一项所述的方法，其中在(1)、(2)、(3)或(5)中，所述衔接子包含GC(在3
’
至5
’
方向)突出端。25.权利要求8至24中任一项所述的方法，其中所述第一一种或更多种限制酶包含MspI、HpaII、TaqαI、或其功能类似物、或其混合物。26.权利要求8至25中任一项所述的方法，其中所述第二一种或更多种限制酶包含以下中的一种或更多种：BspD1、XhoI、SmlI、HpyF30I、PaeR7I、Sfr274I、或其功能类似物、或其混合物。27.权利要求8至26中任一项所述的方法，其中所述连接酶是T7DNA连接酶、T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、Taq DNA连接酶、或其功能类似物、或其混合物。28.权利要求8至27中任一项所述的方法，其中所述多个DNA分子包含无细胞DNA。29.权利要求28所述的方法，其还包括获得cfDNA。30.权利要求29所述的方法，其中所述cfDNA获自或来源于来自对象或个体的样品。31.权利要求30所述的方法，其中所述样品获自或来源于血浆、血清、骨髓、脑脊液、胸膜液、唾液、粪便或尿。32.权利要求30或31所述的方法，其还包括从所述对象或个体获得所述样品。33.权利要求8至32中任一项所述的方法，其中所述衔接子包含已知序列。34.权利要求8至32中任一项所述的方法，其中所述衔接子包含独特序列。35.权利要求8至34中任一项所述的方法，其中针对具有一个或更多个CpG位点的...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪晓晖，向红，
申请(专利权)人：早期诊断有限公司，
类型：发明
国别省市：