一种马兜铃酸A的核酸适配体及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术首次公开了一种能够特异性识别马兜铃酸A的核酸适配体及其应用，属于生物工程领域。本发明专利技术以马兜铃酸A为靶标，运用cpature

【技术实现步骤摘要】
一种马兜铃酸A的核酸适配体及其筛选方法和应用


[0001]本专利技术属于核酸适配体的筛选和应用
，更具体地，涉及一种马兜铃酸A的 核酸适配体及其筛选方法。

技术介绍

[0002]马兜铃酸(AristoLochic acids，简称AAs)也被称为马兜铃总酸、木通甲素，是具 有强烈致癌性和肾毒性的硝基菲羧酸，其中马兜铃酸A是天然存在最广，含量最高，肾 毒性和致癌致突变风险最大的一类。目前不同的国家采取了不同的措施来应对马兜铃酸 的毒性问题，如大多数国家/地区都禁止使用含AAs的产品，但全世界任然不定期出现 马兜铃酸肾损伤的病例，同时尚有一些马兜铃酸含量相对较低的马兜铃科中药材及其制 剂未予禁用，因此对含有或可能含有AAs中药及其制剂进行含量测定及严格的质量控 制标准对指导临床合理用药尤其重要。
[0003]SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)是一种新型的体外筛选技术，所得 的适配体主要为短DNA或RNA的单链寡核苷酸序列，能形成发夹、茎环、假节等二级 结构与靶分子匹配的特异性空间构象，具有很强的特异性和亲和性；该技术所筛选的靶 标分子范围广泛，可涉及金属离子，肽，毒素等小分子，酶，蛋白，抗体等大分子物质 以及完整的病毒、细菌、活细胞及病理组织切片等。适配体与抗体相比，分子小，筛选 周期短、可体外化学合成、可反复使用，且易于标记和修饰，高稳定性和低免疫原性， 长期保存和室温运输。SELEX筛选的主要步骤包括:文库或靶标固定、靶标洗脱、非结 合文库分离、结合适配体扩增和单链制备。通常将靶标固定在固体上，如磁性微球、琼 脂糖珠、氧化石墨烯等，但对于小分子没有足够官能团以固定于固体表面,并且小分子靶 标固定于磁珠表面将会占据的小分子的官能团而降低筛选效率，Capture
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SELEX是一种 替代方法，通过将寡核苷酸库固定在固体基质上而不是将靶标物固定。目前为止 Capture
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SELEX已经成功选择了如镉，青霉素，喹诺酮，脂多糖等小分子靶标。
[0004]本专利技术使用SELEX技术首次筛选得到马兜铃酸A的适配体，对于检验微量AAs 有着重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是运用一种capture
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SELEX技术，通过将寡核苷酸库固定在固体基质 上而不是将靶标物固定，解决对于固定小分子困难的筛选问题，提供一种特异性强亲和 力高的马兜铃酸A核酸适配体，还相应地提供所述适配体的筛选方法与应用，并通过截 短和构建稳定的二级结构进一步改善核酸适配体的性能，为后续检测马兜铃科属中药、 可能含马兜铃酸A的中药及其产品的方法建立奠定基础。
[0006]本专利技术所采取的技术方案是：
[0007]一种马兜铃酸A的核酸适配体，其特征在于，所述适配体序列如SEQ1所示或SEQ2， SEQ3所示的截短序列。
[0008]所述的核酸适配体，其特征在于，所述的核酸适配体可连接荧光标记物、生物素、 纳米材料或放射性物质。
[0009]所述的核酸适配体，其特征在于，对所述核酸适配体做截短或延长或部分碱基替换 的结构改造所得到的产物进行连接荧光标记物、生物素、纳米材料、放射性物质修饰。
[0010]所述的核酸适配体在检测含有马兜铃酸A的药品、食品、农产品及其他产品方面的 应用。
[0011]一种检测中药中马兜铃酸A的方法，其特征在于，设计了两条无标记单链DNA (cDNA
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G和r
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cDNA
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G)，包含G
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四链体形成的序列，且cDNA
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G的3
’
端部分碱基 与马兜铃酸A适配体互补配对。
[0012]所述马兜铃酸A核酸适配体的筛选方法，包括如下步骤：
[0013]S1.文库固定：将ssDNA文库固定于链霉亲和素琼脂糖微球表面，洗涤，得洗涤液；
[0014]S2.靶标筛选分离：将马兜铃酸A加入琼脂糖微球复合物中，过柱，洗脱，得洗脱液； 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
[0015]S3.文库扩增：PCR扩增，ssDNA适配体回收；
[0016]S4.测序：将富集的文库进行高通量测序；
[0017]S5.验证：对测序后序列进行二级结构预测，并检测适配体对马兜铃酸A的亲和力及特 异性，筛选出高亲和力特异性强的核酸适配体。
[0018]更进一步地，所述的马兜铃酸A核酸适配体筛选方法，步骤S1中取200μL的链霉亲和 素琼脂糖微球于微柱中，并用1
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buffer结合缓冲液清洗平衡柱环境，每次250μL。
[0019]更进一步地，所述的马兜铃酸A核酸适配体筛选方法，步骤S1中将250μL的ssDNA 文库与捕获cDNA以1：5的物质的量比率进行杂交退火，95℃10min，自然冷却至室温， 再与清洗和平衡后的链霉亲和素琼脂糖微球混合洗涤5次，得洗脱液；微球柱用缓冲液 清洗多次以除去未结合文库。
[0020]更进一步地，所述的马兜铃酸A核酸适配体筛选方法，在步骤S2中不对靶标小分子进 行修饰，最大限度与ssNDA相互作用，低亲和力适配体也易分离及表征。
[0021]更进一步地，所述的马兜铃酸A核酸适配体筛选方法，在步骤S2中，按筛选条件配制 750μL一定浓度的靶标物溶液，每次取250μL靶标物溶液分3次进行过柱洗脱，收集洗 脱液。
[0022]更进一步地，所述的马兜铃酸A核酸适配体筛选方法，在步骤S2中，在第11轮实施反 筛选且可对反筛选过程条件进行调整，以除去非特异性适配体。
[0023]更进一步地，所述的马兜铃酸A核酸适配体筛选方法，在步骤S2中，将收集的3次加 入靶标物后的洗脱液通过3解离常数的超滤管离心浓缩以对其进行文库扩增。
[0024]更进一步地，所述的马兜铃酸A核酸适配体筛选方法，在步骤S2中，取一定量的文库 ssDNA的退火后溶液，文库与微球结合后的洗脱液，缓冲液清洗未结合上去的洗脱液， 靶标物的洗脱液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳实验以监控筛选过程中文库富集情况。 优先地，所述的马兜铃酸A核酸适配体筛选方法，在步骤S3中具体的PCR条件为：Mix 25μL，FP 5μL，RBP 5μL，适配体5μL，去离子水10μL，反应条件为95℃2min，95℃ 15S，58℃30S，72℃45S，11个循环，72℃5min。
[0025]更进一步地，所述的马兜铃酸A核酸适配体筛选方法，在步骤S3中加入生物素化反
向 引物进行PCR，产物与链霉亲和素琼脂糖微球柱混匀，洗涤，碱变性获得ssDNA链并 分离。
[0026]更进一步地，所述的马兜铃酸A核酸适配体筛选方法，在步骤S4中，在第10轮及第 15轮文库进行高通量测序。
[0027]更进一步地，所述的马兜铃酸A核酸适配体筛选方法，步骤S5中采用MST微量热泳 动分子互作检测适配体的亲和力与特异性。
[0028]在本专利技术的另一个方面中，经过本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种马兜铃酸A的核酸适配体，其特征在于，所述适配体序列如SEQ1所示、SEQ2或SEQ3所示。2.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述的核酸适配体可连接荧光标记物、生物素、纳米材料或放射性物质。3.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，对所述核酸适配体做截短或延长或部分碱基替换的结构改造所得到的产物进行连接荧光标记物、生物素、纳米材料、或放射性物质修饰。4.一种权利要求1所述的马兜铃酸A核酸适配体筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.文库固定：将ssDNA文库固定于链霉亲和素琼脂糖微球表面，洗涤，得洗涤液；S2.靶标筛选分离：将马兜铃酸A加入琼脂糖微球复合物中，过柱，洗脱，得洗脱液；进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；S3.文库扩增：PCR扩增文库，ssDNA适配体回收S4.高通量测序：将富集的文库进行高通量测序；S5.验证：对测序后序列进行二级结构预测，并检测适配体对马兜铃酸A的亲和力及特异性，筛选出高亲和力特异性强的核酸适配体。5.如权利要求1
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3任意一项所述的核酸适配体在检测产品中马兜铃酸A的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的产品为药品、食品、农产品。7.一种检测产品中马兜铃酸A的方法，其特征在于，设计了两条无标记单链DNA cDNA
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G和r
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【专利技术属性】
技术研发人员：余伯阳，刘秀峰，陈美琪，田蒋为，李纪伟，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：