一种降低抗体类蛋白高聚甘露糖型水平的方法技术

提供了一种生产抗体蛋白的方法：该方法包括以下步骤：a)接种细胞并在36

【技术实现步骤摘要】
一种降低抗体类蛋白高聚甘露糖型水平的方法
(1)

[0001]本专利技术属于生物制药领域，特别是哺乳动物细胞批次补料培养
，涉及抗体类蛋白N
‑
糖基化修饰的调节方法。
(2)
技术介绍

[0002]糖基化是在酶的控制下，蛋白质或脂质附加上糖类的过程，起始于内质网，结束于高尔基体。在糖基转移酶作用下将糖转移至蛋白质，和蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键。蛋白质经过糖基化作用，形成糖蛋白。糖基化是对蛋白的重要的修饰作用，有调节蛋白质，帮助蛋白质折叠功能作用。
[0003]在生物制药领域，抗体类药物被广泛应用于疾病治疗，高聚甘露糖型是抗体 N
‑
糖基化修饰中一种常见的非成熟化糖型，CHO细胞表达抗体的高聚甘露糖型主要是Man 5(五聚甘露糖型)，高比例的Man 5使抗体在人体中的清除效率增加，从而影响抗体类药物的药物代谢动力学和药效动力学参数，因此Man 5水平常是抗体类药物的一个重要质量参数，降低Man 5水平往往是新药或生物类似药开发过程中追求的目标。
[0004]影响抗体高聚甘露糖型水平的因素主要有两方面，一是细胞株本身的翻译后修饰能力，二是细胞培养工艺条件。目前，在细胞培养工艺方面可有效提高高聚甘露糖型水平的方法有：一、添加α
‑
甘露糖苷酶I/II抑制剂，如几夫碱，1
‑
脱氧甘露伊酶素，甘露抑素A；二、添加塔格糖或棉子糖降低糖基化修饰过程中的 UDP
‑
GlcNac底物水平；三、添加高尔基体pH中和剂莫能霉素。相反，现有的有效降低高聚甘露糖型水平的方法有限，经文献报道的方法有每日添加锂或单次添加一定量的MnCl2；然而，另有文献证明添加锰离子可提高Man 5水平，而在实际应用过程中，金属离子添加物对甘露糖基化修饰水平的影响无明显规律，同时，由于在生产过程中引入非常规添加物，最终的抗体药物产品中是否有该物质的残留，残留浓度检测，其残留浓度是否安全都是本领域技术人员未知的，有待探究与验证，这对于抗体类药物生产和质量监控造成了风险。
[0005]在已披露的文献中，有学者提出培养工艺中的pH条件能影响Man 5的水平，但无明确的pH控制策略。有些学者专注在对高Man5产生的原因的研究，即高pH 条件下，细胞代谢副产物NH4
+
水平提高，导致高尔基体pH提高，抑制糖基化成熟的修饰过程，从而使Man5水平增高，但没有说明能通过降低pH降低NH4
+
从而使 Man5水平降低；而事实上，细胞代谢副产物NH4
+
浓度受众多因素影响，目前在细胞培养工艺界没有有效降低NH4
+
水平的控制方法。也有学者整体研究了pH对Man5 修饰水平的全局影响，有文献报道高pH组(7.10)相对于低pH组(6.80)，Man5 水平更低；另外也有文献报道，在6.8
‑
7.8pH范围内，pH对Man5的影响因细胞系的不同而不同。总的来说，依据已有文献的报道，可以明确细胞培养过程中的 pH条件对产物蛋白的Man5修饰水平有影响，但具体到如何影响，采用何种方式以及将pH控制到什么水平可以对Man5进行有效调控并不明确。
(3)
技术实现思路

[0006]因此，本专利技术的一个目的是提供一种有效在生产过程中降低抗体类药物中 Man5的手段。
[0007]为了解决以上技术问题，在本专利技术的一个方面提供了一种生产抗体蛋白的方法：该方法包括以下步骤：
[0008]a)接种细胞并在36
‑
37℃，优选36.5℃培养，控制第一pH在7.00
±
0.20范围的第一pH；
[0009]b)在细胞生长到指数期中后期，优选达到20
×
106/ml的培养密度后，开始降低培养温度至30
‑
32℃，优选31℃，在降温日同时添加HCl使pH下降，至范围在 6.7
‑
6.90的第二pH，所述第一pH大于第二pH，维持该pH直到收获细胞，并在pH 稳定后，加入CO2气体达到第一CO2分压为50
‑
80mmHg；
[0010]c)在细胞生长达到平台期后，维持pH并提高CO2气体至第二分压为 80
‑
110mmHg，所述第二分压高于第一分压；和
[0011]d)收获细胞并收集抗体蛋白产物CO2。
[0012]在该方面的一个优选方式中，步骤b)在降温日后到细胞生长平台期的天数为降温日后3
‑
7天，优选5天。
[0013]在该方面的另一个优选方式中，其中在平台期后提高CO2气体分压，继续培养2
‑
4天，然后收获细胞CO2。
[0014]在该方面的另一个优选方式中，其中所述培养在Actipro培养基中进行的。
[0015]在该方面的还有一个优选方式中，还包括在接种前使用Actipro培养基培养。
[0016]在该方面的还有另一个方面中，还包括在培养过程中补充CB7a/b培养基，每次优选补充为3％培养液重量，优选在培养的第3、5、7、10天进行补充。
[0017]在本专利技术的另一个方面，提供了一种控制抗体蛋白生产中的糖基化水平的方法，包括以下步骤：
[0018]a)接种细胞并在36
‑
37℃，优选36.5℃培养，控制第一pH在7.00
±
0.20范围的第一pH；
[0019]b)在细胞生长到指数期中后期，优选达到20
×
106/ml的培养密度后，开始降低培养温度至30
‑
32℃，优选31℃，在降温日同时添加HCl使pH下降，至范围在 6.7
‑
6.90的第二pH，所述第一pH大于第二pH，维持该pH直到收获细胞，并在pH 稳定后，加入CO2气体达到第一CO2分压为50
‑
80mmHg；
[0020]c)在细胞生长达到平台期后，维持pH并提高CO2气体至第二分压为 80
‑
110mmHg，所述第二分压高于第一分压；和
[0021]d)收获细胞并收集抗体蛋白产物CO2。
[0022]在该方面的一个优选方式中，步骤b)在降温日后到细胞生长平台期的天数为降温日后3
‑
7天，优选5天。
[0023]在该方面的另一个优选方式中，其中在平台期后提高CO2气体分压，继续培养2
‑
4天，然后收获细胞CO2。
[0024]在该方面的另一个优选方式中，其中所述培养在Actipro培养基中进行的。
[0025]在该方面的还有一个优选方式中，还包括在接种前使用Actirpo培养基培养。
[0026]在该方面的还有另一个方面中，还包括在培养过程中补充CB7a/b培养基，每次优选补充为3％培养液重量，优选在培养的第3、5、7、10天进行补充。
[0027]在本专利技术的一个具体实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产抗体蛋白的方法：该方法包括以下步骤：a)接种细胞并在36
‑
37℃，优选36.5℃培养，控制初始pH在7.00
±
0.20范围的第一pH；b)在细胞生长到指数期中后期后，开始降低培养温度至30
‑
32℃，优选31℃，在降温日同时添加HCl使pH下降，至范围在6.7
‑
6.90的第二pH，所述第一pH大于第二pH，维持该pH直到收获细胞，并在pH稳定后，加入CO2气体达到第一CO2分压为50
‑
80mmHg；c)在细胞生长达到平台期后，维持pH并提高CO2气体至第二分压为80
‑
110mmHg，所述第二分压高于第一分压；和d)收获细胞并收集抗体蛋白产物CO2。2.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)在降温日后到细胞生长平台期的天数为降温日后3
‑
7天，优选5天。3.如权利要求1所述的方法，其中在平台期后提高CO2气体分压，继续2
‑
4天，然后收获细胞CO2。4.如权利要求1所述的方法，其中所述培养在Actipro培养基中进行。5.如权利要求1所述的方法，其中还包括在接种前使用Actipro培养基培养。6.如权利要求1所述的方法，其中还包括在培养过程中补充CB7a/b培养基。7.一种控制抗体蛋白生产中的糖基化水平的方法，包括以下步骤：a)接种细胞并在36
‑
37℃，优选36.5℃培养，控制初始pH在7.00
±
0.20范围的第一pH；b)在细胞生...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈孝欢，程吕，孙瑞强，
申请(专利权)人：上海药明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：