HDGF对动脉粥样硬化的影响制造技术

本发明专利技术公开了HDGF对动脉粥样硬化的影响，属于生物医学领域。本申请通过构建小鼠模型，明确了HDGF促进AS发生发展的作用，并且验证了Mettl3介导HDGF的RNA

【技术实现步骤摘要】
HDGF对动脉粥样硬化的影响


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及HDGF对动脉粥样硬化的影响。

技术介绍

[0002]心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)已成为现代社会威胁人类健康的公共卫生问题，尽管全球医疗卫生水平在不断提升，但CVD仍然是危害人类生命健康的头号杀手。据美国心脏病学会(AHA)统计，到2030年，CVD引起的死亡人数将增至2360万以上，而动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是导致卒中和心衰等严重CVD的重要病理基础。
[0003]巨噬细胞作为炎性因子的主要来源和斑块内先天性免疫应答的主要细胞在AS各个阶段都发挥关键作用。巨噬细胞是治疗AS的重要干预靶点，通过干预巨噬细胞来减少斑块内炎症反应和稳定斑块，对预防急性心血管事件的发生具有重要意义。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提出了HDGF对动脉粥样硬化的影响，具体通过小鼠模型进行研究与反映。
[0005]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0006]一种小鼠模型构建方法，包括以下步骤：
[0007]步骤1：构建雄性ApoeKO小鼠和单核细胞特异性HDGF敲除的ApoeKO小鼠(HDGFMac
‑
KOApoeKO)，分别给予正常和高脂饮食喂养；检测动物模型血脂含量；检测HDGF含量以及HDGF与巨噬细胞的共定位，检测血管中M1和M2型巨噬细胞特征标记物含量、测血浆中炎症因子的表达、斑块内活性氧水平与血管舒张功能；
[0008]步骤2：将ApoeKO和HDGFMac
‑
KOApoeKO分别给予尾静脉注射腺病毒过表达HDGF进行补救实验，给予正常和高脂饮食喂养，重复上述动物检测实验，检测恢复HDGF后是否促进ApoeKO小鼠AS斑块的生成；
[0009]步骤3：构建小鼠骨髓来源的两种单核细胞模型，体外分别给予LPS+IFNγ诱导M1型巨噬细胞，给予IL
‑
4诱导M2型巨噬细胞，检测细胞内HDGF的含量；通过siRNA和腺病毒转染建立HDGF缺失和过表达细胞模型，再给予LPS+IFNγ和IL
‑
4刺激，检测M1和M2型巨噬细胞相关靶蛋白的表达，炎症因子的含量；给予ox
‑
LDL刺激后进行染色检测细胞内脂质含量。
[0010]可选地，还包括以下步骤：构建雄性ApoeKO小鼠和单核细胞特异性HDGF敲除的ApoeKO小鼠分别给予正常和高脂饮食喂养，抑制小鼠糖酵解通路，检测斑块内糖摄取水平，检测斑块糖酵解酶HK1、PFKFB3和LDHA的mRNA和蛋白变化及相应酶的活性；检测斑块中ATP、ADP和NAD+等代谢产物含量；提取骨髓来源巨噬细胞，检测细胞外酸化率、糖酵解水平以及耗氧率；
[0011]建立人外周血和小鼠骨髓来源的两种单核细胞，通过siRNA和腺病毒转染建立HDGF缺失和过表达细胞模型，给予2
‑
DG预处理、LPS+IFNγ和IL
‑
4刺激，检测2
‑
NBD
‑
脱氧葡萄糖摄取反应糖酵解水平、氧化磷酸化水平、细胞中ATP、ADP和NAD+等代谢产物含量、PDHK1
的蛋白表达和活性以及线粒体膜电位；
[0012]建立人外周血和小鼠骨髓来源的两种单核细胞，通过siRNA和腺病毒转染建立HDGF缺失和过表达细胞模型，体外给予LPS+IFNγ和IL
‑
4刺激，收集细胞进行RNA
‑
seq测序和代谢组学分析。
[0013]可选地，通过油红O染色检测斑块脂质含量，通过Masson染色检测斑块胶原含量，通过HE染色检测斑块面积、计算内膜/中膜比值。
[0014]可选地，还包括以下步骤：
[0015]构建雄性ApoeKO小鼠和单核细胞特异性Mettl3敲除的小鼠，分别给予正常和高脂饮食喂养周，抑制小鼠糖酵解通路；检测所述小鼠的血脂含量、斑块脂质含量、斑块胶原含量、斑块面积、内膜/中膜比值、HDGF含量、HDGF与巨噬细胞的共定位、血管中M1和M2型巨噬细胞特征标记物含量、血浆中炎症因子的表达、斑块内糖摄取水平、斑块糖酵解酶HK1、PFKFB3和LDHA的mRNA和蛋白变化及相应酶的活性、以及斑块中ATP、ADP和NAD+等代谢产物含量；提取骨髓来源巨噬细胞，检测所述巨噬细胞的2
‑
NBD
‑
脱氧葡萄糖摄取反应糖酵解水平与氧化磷酸化水平；
[0016]将ApoeKO和Mettl3Mac
‑
KOApoeKO分别给予尾静脉注射腺病毒过表达Mettl3进行补救实验，给予正常和高脂饮食喂养16周，重复上述步骤，检测是否恢复Mettl3后HDGF含量增加并促进ApoeKO小鼠AS斑块的生成；
[0017]建立人外周血和小鼠骨髓来源的两种单核细胞，通过siRNA和腺病毒转染建立Mettl3缺失和过表达细胞模型，给予2
‑
DG预处理，LPS+IFNγ和IL
‑
4刺激24h，mRNA半衰期实验检测M1型巨噬细胞内HDGF mRNA的稳定性，及RNA
‑
m6A修饰对HDGF表达的影响；检测M1和M2型巨噬细胞相关靶蛋白的表达和炎症因子的含量，以及细胞内糖酵解和氧化磷酸化水平；收集细胞进行MeRIP
‑
seq，检测HDGF发生m6A修饰的水平及具体的修饰位点。
[0018]可选地，通过腹腔注射糖酵解通路抑制剂2
‑
脱氧
‑
D葡萄糖抑制小鼠糖酵解通路。
[0019]本专利技术的有益效果：
[0020]与现有的实验模型相比，本专利技术构建的小鼠模型：
[0021]明确HDGF促进AS发生发展的作用；
[0022]验证Mettl3介导HDGF的RNA
‑
m6A修饰稳定HDGF蛋白表达，改变能量代谢重编程诱导M1型巨噬细胞极化促进AS形成的分子机制。
[0023]通过本专利技术的方法构建的小鼠模型，能够作为研究平台反应HDGF对动脉粥样硬化的影响与作用机理，具有较高的研究价值。
附图说明
[0024]下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。
[0025]图1为本申请的小鼠模型反映的HDGF参与AS发展过程中巨噬细胞极化；
[0026]图2为本申请的小鼠模型反映的HDGF通过调控能量代谢重编程诱导M1型巨噬细胞极化；
[0027]图3为本申请的小鼠模型反映的巨噬细胞特异性敲除HDGF的Apoe
KO
小鼠抑制动脉粥样硬化形成；
[0028]图4为本申请的小鼠模型反映的RNA
‑
m6A修饰酶Mettl3介导HDGF的蛋白稳定表达；
[0029]图5为本申请的小鼠模型反映的Mettl3通过HDGF调控能量代谢重编程介导M1巨噬细胞极本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小鼠模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：构建雄性Apoe
KO
小鼠和单核细胞特异性HDGF敲除的Apoe
KO
小鼠(HDGF
Mac
‑
KO
Apoe
KO
)，分别给予正常和高脂饮食喂养；检测动物模型血脂含量；检测HDGF含量以及HDGF与巨噬细胞的共定位，检测血管中M1和M2型巨噬细胞特征标记物含量、测血浆中炎症因子的表达、斑块内活性氧水平与血管舒张功能；步骤2：将Apoe
KO
和HDGF
Mac
‑
KO
Apoe
KO
分别给予尾静脉注射腺病毒过表达HDGF进行补救实验，给予正常和高脂饮食喂养，重复上述动物检测实验，检测恢复HDGF后是否促进Apoe
KO
小鼠AS斑块的生成；步骤3：构建小鼠骨髓来源的两种单核细胞模型，体外分别给予LPS+IFNγ诱导M1型巨噬细胞，给予IL
‑
4诱导M2型巨噬细胞，检测细胞内HDGF的含量；通过siRNA和腺病毒转染建立HDGF缺失和过表达细胞模型，再给予LPS+IFNγ和IL
‑
4刺激，检测M1和M2型巨噬细胞相关靶蛋白的表达，炎症因子的含量；给予ox
‑
LDL刺激后进行染色检测细胞内脂质含量。2.根据权利要求1所述的小鼠模型构建方法，其特征在于，还包括以下步骤：构建雄性Apoe
KO
小鼠和单核细胞特异性HDGF敲除的Apoe
KO
小鼠分别给予正常和高脂饮食喂养，抑制小鼠糖酵解通路，检测斑块内糖摄取水平，检测斑块糖酵解酶HK1、PFKFB3和LDHA的mRNA和蛋白变化及相应酶的活性；检测斑块中ATP、ADP和NAD
+
等代谢产物含量；提取骨髓来源巨噬细胞，检测细胞外酸化率、糖酵解水平以及耗氧率；建立人外周血和小鼠骨髓来源的两种单核细胞，通过siRNA和腺病毒转染建立HDGF缺失和过表达细胞模型，给予2
‑
DG预处理、LPS+IFNγ和IL
‑
4刺激，检测2
‑
NBD
‑
脱氧葡萄糖摄取反应糖酵解水平、氧化磷酸化水平、细胞中ATP、ADP和NAD
+
等代谢产物含量、PDHK1的蛋白表达和活性以及线粒体膜电位；建立人外周血和小鼠...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑龙彬，李雪松，尹宁，秦卫民，梁文波，任志强，
申请(专利权)人：南京医科大学附属逸夫医院，
类型：发明
国别省市：