一种BCR-ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种BCR

【技术实现步骤摘要】
一种BCR
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ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种BCR
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ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]慢性髓系白血病(CML)是一种以中晚幼粒细胞恶性增殖为特征的疾病，约90％～95％的CML患者中可检测到BCR
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ABL融合基因(即9号染色体上的ABL基因易位到22号染色体上的BCR基因上形成融合基因)，可用于CML的分型诊断、疗效评价，以及作为微小残留病的检测和预后评估的可靠指标。
[0003]目前，临床常用检测方法包括常规染色体分析、荧光原位杂交(FISH)和荧光定量PCR。NCCN指南推荐CML患者达到CCyR(完全细胞学缓解)后应该每三个月进行一次BCR
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ABL荧光定量PCR检测，用来监测残留白血病细胞有否上升、下降或处于稳定状态。
[0004]目前，BCR
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ABL荧光定量PCR检测已国际标准化，考虑到实验的不同条件(如不本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种BCR
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ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：分别制备ABL野生型装甲RNA和BCR
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ABL融合型装甲RNA；使用保护稀释液分别对所述ABL野生型装甲RNA和BCR
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ABL融合型装甲RNA进行溶解；通过数字PCR对所述ABL野生型装甲RNA和BCR
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ABL融合型装甲RNA的浓度进行检测；使用保护稀释液对所述ABL野生型装甲RNA和BCR
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ABL融合型装甲RNA进行梯度稀释，得到校准品；将ABL野生型装甲RNA校准品和BCR
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ABL融合型装甲RNA校准品按比例混合，得到参考品。2.根据权利要求1所述的BCR
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ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法，其特征在于，编码所述ABL野生型装甲RNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；优选地，编码所述BCR
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ABL融合型装甲RNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；优选地，所述溶解前还包括将所述ABL野生型装甲RNA和BCR
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ABL融合型装甲RNA在85～95℃下水浴裂解4～8min的步骤；优选地，所述保护稀释液包括Tris
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EDTA缓冲液、保护核酸和保护剂；优选地，所述Tris
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EDTA缓冲液的pH为7.0～8.5；优选地，所述保护核酸包括载体RNA和/或鲑鱼精DNA；优选地，所述保护核酸的终浓度为10～60ng/μL；优选地，所述保护剂包括Triton X
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100和/或Tween20；优选地，所述Triton X
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100的终浓度为0.005％～0.05％；优选地，所述Tween20的终浓度为0.05％～0.5％。3.根据权利要求1或2所述的BCR
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ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法，其特征在于，所述数字PCR的反应体系包括引物对、荧光探针和预混液；优选地，所述引物对在所述反应体系中的终浓度为600～1200nM，所述荧光探针在所述反应体系中的终浓度为80～400nM；优选地，扩增所述ABL野生型装甲RNA的引物对的序列如SEQ ID No.3～4所示，检测所述ABL野生型装甲RNA的荧光探针的序列如SEQ ID No.5所示；优选地，扩增所述BCR
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ABL融合型装甲RNA的引物对的序列如SEQ ID No.6～7所示，检测所述BCR
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ABL融合型装甲RNA的荧光探针的序列如SEQ ID No.8所示；优选地，所述荧光探针的5
’
端标记有荧光发生基团，3
’
端标记有荧光淬灭基团；优选地，所述荧光发生基团包括FAM、HEX、VIC、TAMRA、ROX、Cy3或Cy5中的任意一种；优选地，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任意一种；优选地，所述预混液包括缓冲液、反转录酶、DNA聚合酶和dNTPs；优选地，所述数字PCR的反应程序包括：反转录：40～60℃，13～16min；预变性：94～98℃，8～12min；循环扩增：94～98℃，10～30s；50～60℃，20～60s；循环40～50次。4.根据权利要求1～3任一项所述的BCR
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ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法，其特征在于，所述梯度稀释后，ABL野生型装甲RNA校准品和BCR
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ABL融合型装甲RNA校准品的终浓度依次为(1～5)
×
105拷贝/μL、(1～5)
×
104拷贝/μL、(1～5)
×
103拷贝/μL、(1～
5)
×
102拷贝/μL、(1～5)
×
101拷贝/μL和1～5拷贝/μL；优选地，所述参考品中，ABL野生型装甲RNA校准品和BCR
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ABL融合型装甲RNA校准品的浓度比例依次为10:1、100:1、1000:1和10000:1。5.根据权利要求1～4任一项所述的BCR
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ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：(1)装甲RNA的制备：分别制备ABL野生型装甲RNA和BCR
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ABL融合型装甲RNA，其中，编码所述ABL野生型装甲RNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码所述BCR
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ABL融合型装甲RNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；(2)溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：程雪涛，王洁，张亚飞，
申请(专利权)人：迈杰转化医学研究苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：