透明质酸-ES2-AF肽偶联物及其制备方法和应用技术

本申请提供透明质酸

【技术实现步骤摘要】
透明质酸
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ES2
‑
AF肽偶联物及其制备方法和应用


[0001]本申请涉及生物医药
，具体涉及透明质酸
‑
ES2
‑
AF肽偶联物及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]本专利技术
技术介绍
中公开的信息旨在增加对本专利技术总体背景的理解，而该公开不应必然被视为承认或以任何形式暗示该信息已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]内皮抑素(Endostatin，ES，“IVRRADRAAVP”)最初是从培养的鼠血管内皮细胞瘤细胞系的上清液中分离出来的，一种新型的含有183个氨基酸、分子量为20kDa血管生成抑制剂，具有抑制肿瘤血管生成的能力，表现出强大的抗内皮细胞活性，包括抑制内皮细胞增殖、迁移、粘附等。引入VEGF受体1的选择性拮抗六肽Anti
‑
Flt1(“GNQWFI”)可以更好地靶向于肿瘤血管内皮细胞的VEGF受体，抑制内皮细胞迁移和管腔形成。现有ES
‑
2与Anti
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Flt1通过五个甘氨酸连接架桥化学固相合成的ES2
‑
AF肽可以通过多靶点共同作用更好的抑制肿瘤血管生成。虽然ES2
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AF肽链延长，但仍因体内半衰期短较短体、稳定性较差等缺点，而应用受到限制。

技术实现思路

[0004]为了改善现有技术的不足，本专利技术提供了一种透明质酸
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ES2
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AF肽偶联物及其制备方法和应用。本专利技术通过以己二酸二酰肼(Adipic acid dihydrazide,ADH)与4
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羧基苯甲醛(4
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Carboxybenza
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ldehyde,CBA)相连得到的衍生物作为酸敏感连接桥，该连接桥简称为ADH
‑
CBA，将化学固相合成的抗血管内皮生成的ES2
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AF肽连接到亲水性的透明质酸(Hyaluronic acid,HA)分子骨架上，从而成功制备得到透明质酸
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ES2
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AF肽偶联物，其具有良好的稳定性和生物活性，因此具有良好的实际应用价值。
[0005]具体地，本专利技术提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本专利技术的技术方案。
[0006]在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种透明质酸
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ES2
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AF肽偶联物，其包含ES2
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AF肽和透明质酸(HA)，和由4
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羧基苯甲醛(CBA)与己二酸二酰肼(ADH)形成的连接桥(即ADH
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CBA)，其中，所述连接桥将ES2
‑
AF肽和透明质酸相连。
[0007]在本专利技术的实施方式中，所述连接桥中，4
‑
羧基苯甲醛与己二酸二酰肼以酰胺键相连。
[0008]在本专利技术的实施方式中，所述连接桥与透明质酸通过酰胺键相连，所述连接桥与ES2
‑
AF肽通过亚胺或甲亚胺键相连。
[0009]在本专利技术的实施方式中，所述ES2
‑
AF肽的序列如SEQ ID NO.1(IVRRADRAAVPGGGGGGNQWFI)所示。
[0010]在本专利技术的一些较优的实施方式中，ES2
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AF的分子量为2254.53Da，HA的分子量为
57000Da。
[0011]本专利技术所述透明质酸
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ES2
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AF肽偶联物的结构简式为HA～ADH
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CBA～ES2
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AF，简称为HEA。在本专利技术的实施方式中，本专利技术所述的透明质酸
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ES2
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AF肽偶联物可以结构简式的形式表示，也可以HEA表示。
[0012]在本专利技术的实施方式中，本专利技术采用ADH
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CBA作为连接桥连接ES2
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AF肽和透明质酸，使ES2
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AF肽在肿瘤微环境中的酸性条件下可以从HEA偶联物中释放出来，成为游离状态，快速到达肿瘤周围内皮细胞发挥抗血管生成作用。
[0013]在本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种制备上述第一方面中所述的透明质酸
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ES2
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AF肽偶联物的方法，其包括：己二酸二酰肼与透明质酸进行酰胺化反应连接至透明质酸上，得到HA
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ADH偶联物，4
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羧基苯甲醛与HA
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ADH偶联物中己二酸二酰肼的游离氨基进行酰胺化反应，得到HA
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ADH
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CBA偶联物，加入ES2
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AF肽，ES2
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AF肽的氨基与HA
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ADH
‑
CBA偶联物中4
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羧基苯甲醛中的醛基进行席夫碱反应，即得。
[0014]在本专利技术的实施方式中，每步反应后可进行纯化的步骤。本领域技术人员可通过本领域的已知方法对本专利技术的偶联物选择适宜的纯化方法。作为示例，在本专利技术的一些实施方式中，本专利技术提供了一种较优的纯化方法，其包括进行透析和冻干。比如，在一些具体地实施方式中，可采用透析袋法进行透析，将反应产物倒入预处理的透析袋中，用水或者乙醇/水混合液透析一至多次后，除去杂质，进行滤膜过滤后预冻，然后放入冷冻干燥机中冻干，即可。
[0015]其中，在纯化得到HEA后，经超声处理，在溶解介质中可形成分散良好、粒度均一的球型结构。
[0016]进一步地，在本专利技术所述的制备透明质酸
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ES2
‑
AF肽偶联物方法，包括：
[0017]制备HA
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ADH偶联物：将HA溶解于水中，加入ADH和EDCI完全溶解后调节pH至酸性，反应完成后，再调节pH至中性，反应产物经纯化即得HA
‑
ADH偶联物；
[0018]制备HA
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ADH
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CBA偶联物：将CBA溶于二甲亚砜中，加入EDCI和NHS作为催化剂活化CBA中的羧基；将HA
‑
ADH溶解于水中，缓慢加入上述CBA溶液继续反应，反应完成后，反应产物经纯化后即得HA
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ADH
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CBA偶联物；
[0019]制备HEA偶联物：将HA
‑
ADH
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CBA溶解于缓冲液(pH＝7.4)和二甲亚砜混合液中，加入ES2
‑
AF，室温反应过夜，反应完成后，反应产物经纯化即得HEA偶联物；经过超声法处理，在溶解介质中可以形成分散良好、粒度均一的球型结构。
[0020]在制备HA
‑
ADH偶联物的过程中，调节pH至酸性具体为加入本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种透明质酸
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ES2
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AF肽偶联物，其特征在于，其包含ES2
‑
AF肽和透明质酸，和由4
‑
羧基苯甲醛与己二酸二酰肼形成的连接桥，其中，所述连接桥将ES2
‑
AF肽和透明质酸相连。2.根据权利要求1所述的透明质酸
‑
ES2
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AF肽偶联物，其特征在于，所述连接桥中，4
‑
羧基苯甲醛与己二酸二酰肼以酰胺键相连。3.根据权利要求1或2所述的透明质酸
‑
ES2
‑
AF肽偶联物，其特征在于，所述连接桥与透明质酸通过酰胺键相连，所述连接桥与ES2
‑
AF肽通过亚胺或甲亚胺键相连。4.根据权利要求1至3中任一项所述的透明质酸
‑
ES2
‑
AF肽偶联物，其特征在于，所述ES2
‑
AF肽的序列如SEQ ID NO.1所示。5.一种制备权利要求1至4中任一项所述的透明质酸
‑
ES2
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AF肽偶联物的方法，其特征在于，己二酸二酰肼与HA进行酰胺化反应连接至HA上，得到HA
‑
ADH偶联物，4
‑
羧基苯甲醛与HA
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭海宁，凌沛学，孙凤，翟光喜，刘元秀，李妍，侯慧文，王洁，唐雯，卢鲁，符家爱，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：