基于线粒体基因组序列开发的老芒麦mtSSR标记引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于区分野生老芒麦和垂穗披碱草的基于线粒体基因组序列开发的老芒麦mtSSR标记引物及其应用，包括4对多态性引物，其核苷酸序列如序列表SEQUENCE IDNO.1～8所示。所述的4对老芒麦mtSSR标记引物能够在老芒麦和近缘物种垂穗披碱草野生种质资源群体结构和物种鉴定上应用，为老芒麦和垂穗披碱草的区分鉴定提供便利，同时本发明专利技术所述的4对老芒麦mtSSR标记引物不但具有细胞核基因组SSR标记的共显性和高多态性等特点，还具有线粒体基因组DNA的单亲遗传模式，不易发生重组，同时填补了老芒麦mtSSR开发的空白，为老芒麦的遗传多样性评价、种质鉴定及分子标记辅助育种等研究奠定了基础。适合在植物生物技术领域推广应用。应用。

【技术实现步骤摘要】
基于线粒体基因组序列开发的老芒麦mtSSR标记引物及其应用


[0001]本专利技术涉及植物生物
，具体涉及一种基于线粒体基因组序列开发的老芒麦 mtSSR标记引物及其应用。

技术介绍

[0002]老芒麦(Elymus sibiricus)和垂穗披碱草(Elymus nutans)是小麦族披碱草属多年生疏丛型草本植物，由于其营养丰富，且对高寒地区的生态适应性良好，现已成为青藏高原等地的优势草种，具有广泛的利用前景。目前栽培利用的老芒麦和垂穗披碱草品种都是在收集优良野生种质的基础上，经过选育而来。准确鉴定和收集野生种质是选育老芒麦和垂穗披碱草优良品种的前提。
[0003]老芒麦和垂穗披碱草均为花序下垂类禾草，通过一些形态学特征可将二者进行初步区分。一般而言，垂穗披碱草的花序更为紧密，小穗排列偏于穗轴的一侧，颖先端具芒尖；而老芒麦的花序疏松，小穗均匀排列在穗轴两侧，颖先端具有短芒。但是，复杂的野外环境如土壤肥力、海拔等会使老芒麦和垂穗披碱草的形态特征存在交叉，难以对二者进行准确的区分。虽然细胞遗传学表明老芒麦为异源四倍体(2n＝4x＝28，SSHH)，垂穗披碱草为异源六倍体 (2n＝6x＝42，SSHHYY)。然而，对野外采集的大量种质资源进行倍性鉴定费时费力，亟需更为有效的分子标记对其进行鉴定。
[0004]SSR(simple sequence repeats)分子标记由于具有基因组广布性、高多态性和高物种转移性而被广泛用于遗传多样性研究、物种区分和品种鉴定等。目前已开发出了一些基因组SSR (G
‑
SSR)和转录组SSR(EST
‑
SSR)用于老芒麦和垂穗披碱草的区分，但未见线粒体SSR (mtSSR)用于区分二者的报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种用于区分野生老芒麦和垂穗披碱草的基于线粒体基因组序列开发的老芒麦mtSSR标记引物。
[0006]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案为：该基于线粒体基因组序列开发的老芒麦 mtSSR标记引物，包括4对多态性引物，其核苷酸序列如序列表SEQUENCE ID NO.1～8所示。
[0007]进一步的是，所述老芒麦mtSSR标记引物采用如下方法得到：
[0008]1)、提取老芒麦植物的线粒体DNA，并对提取的线粒体DNA进行纯度、浓度和完整性检测，剔除纯度、浓度、完整性不合格的DNA片段得到合格DNA片段；
[0009]2)、使用BluePippin全自动核酸回收仪回收步骤1)得到的合格DNA片段；
[0010]3)、利用磁珠对回收的合格DNA片段进行初次纯化处理；
[0011]4)、对初次纯化处理的DNA片段进行损伤及末端修复；
[0012]5)、再次利用磁珠对修复后的DNA片段进行纯化处理得到目的DNA；
[0013]6)、使用SQK
‑
LSK109试剂盒中测序接头将经过步骤5)处理得到的目的DNA片段进行连接得到DNA文库；
[0014]7)、使用Qubit对步骤6)得到的DNA文库进行精确定量；
[0015]8)、将一定浓度和体积的DNA文库加入到Flowcell中，并将Flowcell转移到OxfordNanoporePromethION测序仪进行实时单分子测序获得线粒体基因组全长，并通过高通量Illumina测序结果对其进行校正，然后使用三代组装软件canu对校正后的三代数据进行拼接，设置基因组大小为5m，correctedErrorRate＝0.03，得到contig序列，使用blastv2.6将contig序列比对植物线粒体基因数据库，将比对上线粒体基因的contig做为种子序列，使用原始数据对其进行延伸和环化，得到环状主宰结构，然后使用NextPolish1.3.1用三代数据对组装结果进行校正，再使用pilon软件用二代数据对其进行校正，得到环状的老芒麦线粒体基因组；
[0016]9)、利用MISAperl脚本软件搜索老芒麦线粒体基因组中分布的SSR位点，参数设定分别为：单核苷酸重复序列，重复单元≥8；二核苷酸重复序列，重复单元≥5；三核苷酸重复序列，重复单元≥3；四、五、六核苷酸重复序列，重复单元≥3；
[0017]10)、利用PrimerPremier5软件按照如下引物设计原则进行mtSSR引物设计并筛选得到所述4对老芒麦mtSSR标记引物，所述引物设计原则如下所示：引物长度范围18
‑
26个碱基；退火温度范围50
‑
60℃；产物长度100
‑
300bp。
[0018]本专利技术还提供了上述基于线粒体基因组序列开发的老芒麦mtSSR标记引物在老芒麦和近缘物种垂穗披碱草野生种质资源群体结构和物种鉴定上的应用。
[0019]本专利技术还提供了一种上述基于线粒体基因组序列开发的老芒麦mtSSR标记引物进行老芒麦和近缘物种垂穗披碱草野生种质资源群体结构和物种鉴定的方法，包括如下步骤：
[0020]A、基因组DNA的提取；首先，收集一定数量的老芒麦和一定数量的垂穗披碱草的幼嫩叶片，放入硅胶进行干燥，并采用CTAB法对植物总DNA进行提取，1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，并使用NanoDrop2000对提取的DNA进行纯度检测以及浓度的定量，最终将每个样品的DNA浓度稀释到20ng/μL；
[0021]B、mtSSR
‑
PCR反应；以步骤A提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQUENCEIDNO.1～8所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；PCR扩增体系共15μL，包含3μL模板DNA，0.8μL上下游引物(5pmolμL
‑1)，7.5μLMIX(包含10
×
PCRbuffer，Mg
2+
，dNTPs)，0.4μLTaq酶(2.5UμL
‑1)，2.5μLddH2O；
[0022]C、电泳检测；将步骤B得到的扩增产物进行多态性检测；并对清晰的条带进行统计，采用有带记为“1”，无带记为“0”的原则；
[0023]D、利用STRUCTURE软件构建种质群体结构图。
[0024]进一步的是，在步骤B中，PCR扩增体系共15μL，包含3μL模板DNA，0.8μL上下游引物(5pmolμL
‑1)，7.5μLMIX(包含10
×
PCRbuffer，Mg
2+
，dNTPs)，0.4μLTaq酶(2.5UμL
‑1)，2.5μLddH2O。
[0025]进一步的是，在步骤B中，PCR扩增程序如下：94℃预变性4min；然后94℃变性30s，51
‑
66℃退火30s，72℃延伸1min，共330个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存。
[0026]进一步的是，在步骤C中，将扩增产物进行多态性检测的过程如下所述：将扩增产...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于线粒体基因组序列开发的老芒麦mtSSR标记引物，其特征在于：包括4对多态性引物，其核苷酸序列如序列表SEQUENCE ID NO.1～8所示。2.根据权利要求1所述的基于线粒体基因组序列开发的老芒麦mtSSR标记引物，其特征在于：所述老芒麦mtSSR标记引物采用如下方法得到：1)、提取老芒麦植物的线粒体DNA，并对提取的线粒体DNA进行纯度、浓度和完整性检测，剔除纯度、浓度、完整性不合格的DNA片段得到合格DNA片段；2)、使用BluePippin全自动核酸回收仪回收步骤1)得到的合格DNA片段；3)、利用磁珠对回收的合格DNA片段进行初次纯化处理；4)、对初次纯化处理的DNA片段进行损伤及末端修复；5)、再次利用磁珠对修复后的DNA片段进行纯化处理得到目的DNA；6)、使用SQK
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LSK109试剂盒中测序接头将经过步骤5)处理得到的目的DNA片段进行连接得到DNA文库；7)、使用Qubit对步骤6)得到的DNA文库进行精确定量；8)、将一定浓度和体积的DNA文库加入到Flow cell中，并将Flow cell转移到Oxford Nanopore PromethION测序仪进行实时单分子测序获得线粒体基因组全长，并通过高通量Illumina测序结果对其进行校正，然后使用三代组装软件canu对校正后的三代数据进行拼接，设置基因组大小为5m，correctedErrorRate＝0.03，得到contig序列，使用blast v2.6将contig序列比对植物线粒体基因数据库，将比对上线粒体基因的contig做为种子序列，使用原始数据对其进行延伸和环化，得到环状主宰结构，然后使用NextPolish1.3.1用三代数据对组装结果进行校正，再使用pilon软件用二代数据对其进行校正，得到环状的老芒麦线粒体基因组；9)、利用MISA perl脚本软件搜索老芒麦线粒体基因组中分布的SSR位点，参数设定分别为：单核苷酸重复序列，重复单元≥8；二核苷酸重复序列，重复单元≥5；三核苷酸重复序列，重复单元≥3；四、五、六核苷酸重复序列，重复单元≥3；10)、利用Primer Premier 5软件按照如下引物设计原则进行mtSSR引物设计并筛选得到所述4对老芒麦mtSSR标记引物，所述引物设计原则如下所示：引物长度范围18
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26个碱基；退火温度范围50
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60℃；产物长度100
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300bp。3.根据权利要求1所述的基于线粒体基因组序列开发的老芒麦mtSSR标记引物在老芒麦和近缘物种垂穗披碱草野生种质资源群体结构和物种鉴定上的应用。4.利用权利要求1所述的基于线粒体基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：马啸，熊艳丽，熊毅，余青青，赵俊茗，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：