具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法技术

一种具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法，其中，包含下述的工序：使5'位羟基未被保护、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护、或可结合于固相载体的核苷、核苷酸或寡核苷酸，与3'位羟基或3'位氨基通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法被修饰、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸，在抗氧化剂的存在下缩合，得到亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的工序。到亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法


[0001]本专利技术涉及具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法，可用于核酸合成的领域。

技术介绍

[0002]反义核酸、siRNA(小干扰，small interfering RNA)、适体(aptamer)等核酸药物作为继抗体药物之后的下一代药物受到关注。核酸药物被期待与抗体药物同样高的特异性和有效性，同时可与以往的由小分子化合物形成的药物同样通过化学合成来制造。新型核酸药物的研发中，进行了对核酸间的结合部位的磷原子修饰而得的修饰核酸的探讨。具有磷原子被硫化的硫代磷酸酯化部位(硫代磷酸酯核酸间结合部位)的类型的核酸药物即为其代表，可例举例如福米韦生(Fomivirsen)、米泊美生(Mipomersen)、奥利默森(Oblimersen)、阿利福生(Alicaforsen)等。作为具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法，有固相合成(固相法)和液相法，为了进一步消除固相法和液相法的缺点，还开发有使用拟固相保护基(pseudo solid phaseprotectinggroup)的液相法(专利文献1～9)。
[0003]现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2012/157723号专利文献2：国际公开第2013/122236号专利文献3：国际公开第2017/104836号专利文献4：国际公开第2005/070859号专利文献5：国际公开第2013/179412号专利文献6：国际公开第2014/077292号专利文献7：国际公开第2017/086397号专利文献8：国际公开第2018/203574号专利文献9：国际公开第2018/212236号。

技术实现思路

[0004]专利技术所要解决的技术问题合成具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸时，目前广泛采用亚磷酰胺法和H
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膦酸酯法(H
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phosphonate)等，还已知二卤代膦(dihalophosphine)法和氧氮磷杂环戊烷(oxazaphospholidine)法。亚磷酰胺法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法中合成亚磷酸酯体，H
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膦酸酯法中合成亚磷酸二酯体，分别进一步供于硫化反应来获得作为目标物的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸。然而，专利技术人研究的结果是，发现存在新的问题，即，按照这样的方法合成的情况下，在上述亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体生成的阶段，同时发生磷原子的氧化反应，作为副产物生成磷酸三酯体或磷酸二酯体(以下也称“PO杂质”)，因而其后的硫化反应受到阻碍，无法高效地合成作为目标的硫代磷酸酯化寡核苷酸。该“PO杂质”是原
本应为硫代磷酸酯化部位，但被氧化而形成磷酸三酯体或磷酸二酯体的杂质。本专利技术的课题是解决该新发现的问题，提供可更高效地制造作为目标的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的方法。
[0005]解决技术问题所采用的技术方案本专利技术人等发现通过在使用用于形成亚磷酸酯体的方法(例如，亚磷酰胺法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法)合成亚磷酸酯体的阶段、或者使用用于形成亚磷酸二酯体的方法(例如，H
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膦酸酯法)合成亚磷酸二酯体的阶段，使特定的抗氧化剂共存，可解决该新课题，从而完成了本专利技术。本专利技术如下。
[0006][1]一种具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法，其中，包含下述的工序(1)：使5'位羟基未被保护、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护、或可结合于固相载体的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下有时称为“核酸A”)与3'位羟基或3'位氨基通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法被修饰、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下有时称为“核酸B”)在抗氧化剂的存在下缩合，得到亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的工序。
[0007][2]根据上述[1]所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法，其中，核酸B中，3'位羟基或3'位氨基通过选自亚磷酰胺法、H
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膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法中的方法被修饰；[3]根据上述[1]或[2]所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法，其中，还包括：使工序(1)中得到的亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体与硫化剂反应的工序(工序(2))；[4]一种具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法，其中，包括：(1)使5'位羟基未被保护、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护、或可结合于固相载体的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下也称“核酸A”)与3'位羟基或3'位氨基通过选自亚磷酰胺法、H
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膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法中的方法被修饰、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下也称“核酸B”)在抗氧化剂的存在下缩合，获得亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的工序；以及(2)使所得的亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体与硫化剂反应的工序。
[0008][5]根据上述[1]～[4]中的任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法，其中，抗氧化剂选自磷类抗氧化剂、硫类抗氧化剂、和磷硫类抗氧化剂。
[0009][6]根据上述[1]～[4]中的任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法，其中，抗氧化剂选自：从(1)P
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(R)3(2)P
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(OR)3(3)P(R)2(OR)(4)PR(OR)2(5)PH(O)(R)2(6)PH(O)(OR)2、和(7)PH(O)R(OR)中选择的磷类抗氧化剂
(上述式(1)～(7)中，R可相同或不同，独立地表示任选被取代的芳基、或低级烷基，2个R可以相互结合并与它们所邻接的其他原子一起形成环，在此，上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体)，从(8)R
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S
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R、和(9)[化学式1]中选择的硫类抗氧化剂(上述式(8)、(9)中，R可相同或不同，独立地表示低级烷基或任选被取代的芳基，在此，上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体)，以及(10)以(OR)2P(S)
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S
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M
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S
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P(S)(OR)2表示的磷硫类抗氧化剂(上述式(10)中，R可相同或不同，独立地表示低级烷基或任选被取代的芳基，且M表示Zn、Ni或Cu，在此，上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体)。
[0010][7]根据上述[1]～[4]中的任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法，其中，抗氧化剂选自：从(1)P
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(R)3(2)P
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(OR)3(3)P(R)2(OR)(4)PR(OR)2、和(5)PH(O)R(OR)中选择的磷类抗氧化剂(上述式(1)～(5)中，R可相同或不同，独立地表示任选被取代的芳基、或低级烷基，2个R可以相互结合并与它们所邻接的其他原子一起形成环，在此，上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法，其中，包含下述的工序(1)：使5'位羟基未被保护、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护、或可结合于固相载体的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下有时称为“核酸A”)与3'位羟基或3'位氨基通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法被修饰、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下有时称为“核酸B”)在抗氧化剂的存在下缩合，得到亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的工序。2.根据权利要求1所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法，其中，核酸B中，3'位羟基或3'位氨基通过选自亚磷酰胺法、H
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膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法中的方法被修饰。3.根据权利要求1或2所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法，其中，还包含工序(2)：使工序(1)中得到的亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体与硫化剂反应的工序。4.根据权利要求1～3中任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法，其中，抗氧化剂选自磷类抗氧化剂、硫类抗氧化剂及磷硫类抗氧化剂。5.根据权利要求1～3中任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法，其中，抗氧化剂选自磷类抗氧化剂、硫类抗氧化剂及磷硫类抗氧化剂，所述磷类抗氧化剂选自以下的式(1)～(7)：(1)P
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(R)3、(2)P
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(OR)3、(3)P(R)2(OR)、(4)PR(OR)2、(5)PH(O)(R)2、(6)PH(O)(OR)2、及(7)PH(O)R(OR)，上述式(1)～(7)中，R可以相同或不同，并独立地表示任选被取代的芳基或低级烷基，2个R可以相互结合并与它们所邻接的其他原子一起形成环，在此，上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体；所述硫类抗氧化剂选自以下的式(8)和(9)：(8)R
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S
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R、及(9)上述式(8)、(9)中，R可以相同或不同，并独立地表示低级烷基或任选被取代的芳基，在此，上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体；所述磷硫类抗氧化剂由以下的式(10)表示：(10)(OR)2P(S)
‑
S
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M
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S
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P(S)(OR)2上述式(10)中，R可以相同或不同，并独立地表示低级烷基或任选被取代的芳基，以及M表示Zn、Ni或Cu，
在此，上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体。6.根据权利要求1～3中任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法，其中，抗氧化剂选自磷类抗氧化剂及硫类抗氧化剂，所述磷类抗氧化剂选自以下的式(1)～(5)：(1)P
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(R)3、(2)P
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(OR)3、(3)P(R)2(OR)、(4)PR(OR)2、及(5)PH(O)R(OR)，上述式(1)～(5)中，R可以相同或不同，并独立地表示任选被取代的芳基或低级烷基，2个R可以相互结合并与它们所邻接的其他原子一起形成环，在此，上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体；所述硫类抗氧化剂由以下的式(6)表示：(6)上述式(6)中，R可以相同或不同，并独立地表示低级烷基或任选被取代的芳基，在此，上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体。7.根据权利要求1～3中任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法，其中，抗氧化剂选自：三苯基膦、甲基二苯基膦、亚磷酸三乙酯、二苯基乙氧基膦、苯基膦酸二乙酯、9,10
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二氢
‑9‑
氧杂
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10
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磷杂菲
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10
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氧化物(磷类抗氧化剂)；以及异丁...

【专利技术属性】
技术研发人员：市丸泰介，高桥大辅，平井邦博，山下健，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：