一种非动物源硫酸软骨素寡糖及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种非动物源硫酸软骨素寡糖及其制备方法。本发明专利技术的制备方法包括一步化学法与酶催化法有序进行的步骤：提取大肠杆菌K4多糖，将其化学法脱果糖后，采用硫酸软骨素降解酶降解得到软骨素寡糖混合物；经超滤离心管分离法、Bio

【技术实现步骤摘要】
一种非动物源硫酸软骨素寡糖及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，尤其涉及一种非动物源硫酸软骨素寡糖及其制备方法。

技术介绍

[0002]硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS)，广泛存在于人和动物软骨组织中的一类酸性粘多糖，属于糖胺聚糖的一种。其结构是由葡萄糖醛酸(GlcA)和N
‑
乙酰半乳糖胺(GalNAc)通过β
‑
1,3糖苷键形成二糖单元，重复二糖单元再以β
‑
1，4糖苷键连接形成。CS的糖单元上不同位点被硫酸基团取代，形成不同种类的硫酸软骨素，CS
‑
A、CS
‑
B、CS
‑
C、CS
‑
D、CS
‑
E。CS具有较高的生物活性，如抑制或者促进轴突生长和再生，参与炎症反应，促进成骨等。大量研究表明，CS寡糖与复杂的CS多糖相比，聚合度和结构相对均一，大大地避免了多糖在特殊生物活性中作用机理的模糊性，且分子量小易于吸收，因此我们可以制备结构和分子量可控的寡糖片段来研究其生物活性。
[0003]Zhou ZhengXiong等人采用两步生物学策略生产了CS
‑
A和CS
‑
C，首先优化了重组枯草芽孢杆菌对CH的发酵生产，然后通过芳基磺基转移酶IV(ASST IV)、软骨素4
‑
O
‑
硫酸基转移酶(C4ST)、软骨6
‑
O
‑
硫酸基转移酶(C6ST)组合形成的硫酸化转化系统催化发酵产生的CH合成CS
‑
A和CS
‑
C，转化率分别达到98％和96％。但是，无论是直接发酵生产CS，还是间接发酵生产CH后硫酸化为CS，都存在产物纯化和鉴定的瓶颈问题，尚未有利用发酵法生产结构明确CH或CS的相关报道。
[0004]申请号201711216846.9已经公开了硫酸软骨素D四糖的制备方法，采用了醇沉、阴离子交换色谱分离、凝胶色谱分离等步骤；申请号201210159448.9已经公开了不同分子量寡糖的制备方法，包括酶解、分子筛、离子交换和制备电泳等手段。以上均是专门对高硫酸化的动物源硫酸软骨素，如硫酸软骨素D或硫酸软骨素E寡糖进行高效率纯化。
[0005]目前对非动物源硫酸软骨素特定结构和分子量寡糖的分离制备方法还没有报道。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种非动物源硫酸软骨素寡糖及其制备方法。
[0007]一种非动物源硫酸软骨素寡糖，所述非动物源硫酸软骨素寡糖结构式如下所示：
[0008][0009]其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6独立地选自
‑
H或
‑
SO3H；
[0010]x＝0～2的整数，
[0011]y＝0或1。
[0012]所述的非动物源硫酸软骨素寡糖的制备方法，包括以下步骤：
[0013](1)使用化学法将K4多糖中的葡萄糖醛酸的3
‑
位β连接的果糖脱去，得到DK4；
[0014](2)将步骤(1)中所得DK4与硫酸软骨素降解酶混合进行降解反应，得到软骨素寡糖混合物；
[0015](3)将步骤(2)中所得软骨素寡糖混合物经超滤离心和色谱分离后得到软骨素寡糖，再通过硫酸软骨素磺酸基转移酶将所得软骨素寡糖进行硫酸化修饰，使软骨素寡糖的N
‑
乙酰半乳糖胺(GalNAc)发生4
‑
O
‑
硫酸化或6
‑
O
‑
硫酸化修饰或4
‑
O
‑
硫酸化修饰后6
‑
O
‑
硫酸化修饰，得到所述非动物源硫酸软骨素寡糖；所述硫酸软骨素磺酸基转移酶选自硫酸软骨素4
‑
O
‑
硫酸基转移酶(CS4OST)、硫酸软骨素6
‑
O
‑
硫酸基转移酶(CS6OST)和4
‑
O
‑
硫酸化
‑
GalNAc
‑4‑
O
‑
硫酸基转移酶(GalNAc4S
‑
4OST)中的一种或多种。
[0016]在本专利技术的一个实施例中，步骤(1)中，所述化学法为：将K4多糖溶解于0.01
‑
0.1mol/L酸溶液中，加热去除K4多糖中的葡萄糖醛酸(GlcA)中的果糖残基，冷却至室温后透析，真空冷冻干燥制备得到所述DK4。所述酸选自盐酸、醋酸、硫酸或三氟乙酸。
[0017]在本专利技术的一个实施例中，所述K4多糖与三氟乙酸溶液体积质量比为10:1
‑
15:1(m/v)。
[0018]在本专利技术的一个实施例中，步骤(2)中，所述硫酸软骨素降解酶为硫酸软骨素降解酶ChAC、硫酸软骨素降解酶ChABC或透明质酸酶。
[0019]在本专利技术的一个实施例中，所述软骨素寡糖混合物的纯化方法包括以下步骤：(1)将所述反应液依次通过30kDa、10kDa、3kDa、1kDa超滤离心取上清液，(2)将所得上清液使用Bio
‑
Gel P
‑
2玻璃凝胶层析柱分离取洗脱液，(3)将所得洗脱液浓缩通过HPLC检测并收集在波长为232nm下的分析液，即得所述非动物源组分单一的软骨素寡糖。
[0020]在本专利技术的一个实施例中，步骤(2)中，所述的降解反应包括以下步骤：将DK4溶解在酶解缓冲液中，加入硫酸软骨素降解酶，25
‑
37℃反应10min
‑
24h，待反应结束后，加热并固液分离取滤液，得到所述软骨素寡糖混合物。
[0021]在本专利技术的一个实施例中，所述硫酸软骨素降解酶ChAC酶解缓冲液由15
‑
25mM Tris
‑
HCl水溶液组成，pH值为7.0
‑
7.5；硫酸软骨素降解酶ChABC酶解缓冲液由80
‑
120mM Tris，120
‑
150mM乙酸钠水溶液组成，pH值为7.5
‑
8.0。
[0022]在本专利技术的一个实施例中，所述硫酸软骨素降解酶与DK4的质量比为0.2:12
‑
1:12；酶解反应时间为10min
‑
24h。
[0023]在本专利技术的一个实施例中，步骤(3)中，将软骨素寡糖、硫酸软骨素磺酸转移酶和硫酸基供体3
’‑
磷酸腺苷
‑5’‑
磷酰硫酸盐(PAPS)在缓冲溶液中混合在25
‑
37℃进行反应，反应结束将反应液纯化，得到所述非动物源硫酸软骨素寡糖。
[0024]在本专利技术的一个实施例中，所述缓冲溶液的组分为：0.8
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非动物源硫酸软骨素寡糖，其特征在于，所述非动物源硫酸软骨素寡糖结构式如下所示：其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6独立地选自
‑
H或
‑
SO3H；x＝0
‑
2的整数；y＝0或1。2.一种如权利要求1所述的非动物源硫酸软骨素寡糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使用化学法将K4多糖中的葡萄糖醛酸的3
‑
位β连接的果糖脱去，得到DK4；(2)将步骤(1)中所得DK4与硫酸软骨素降解酶混合进行降解反应，得到软骨素寡糖混合物；(3)将步骤(2)中所得软骨素寡糖混合物经分离纯化后得到软骨素寡糖，再通过硫酸软骨素磺酸基转移酶将所得软骨素寡糖进行硫酸化修饰，使软骨素寡糖的N
‑
乙酰半乳糖胺发生4
‑
O
‑
硫酸化或6
‑
O
‑
硫酸化修饰或4
‑
O
‑
硫酸化修饰后6
‑
O
‑
硫酸化修饰，得到所述非动物源硫酸软骨素寡糖；其中所述硫酸软骨素磺酸基转移酶选自硫酸软骨素4
‑
O
‑
硫酸基转移酶、硫酸软骨素6
‑
O
‑
硫酸基转移酶和4
‑
O
‑
硫酸化
‑
GalNAc
‑4‑
O
‑
硫酸基转移酶中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述化学法为：将K4多糖溶解于酸溶液中，加热去除K4多糖中的葡萄糖醛酸中的果糖残基，冷却至室温后...

【专利技术属性】
技术研发人员：许淑琴，汪竹群，王茂森，陈敬华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：