制备外泌体方法及其药物组合物在组织修复中的应用技术

本发明专利技术涉及制备外泌体方法及其药物组合物在组织修复中的应用。本发明专利技术提供了制备外泌体的方法以及获得了针对天冬氨酸内肽酶的单克隆抗体，将外泌体、bFGF和单克隆抗体三者联合使用之后，可以有效的用于脊髓损伤的治疗中去，并且效果良好，比单独使用外泌体和单抗的效果都要显著。具有很好的市场应用价值。具有很好的市场应用价值。

【技术实现步骤摘要】
制备外泌体方法及其药物组合物在组织修复中的应用


[0001]本专利技术涉及生物领域，更具体的，涉及制备外泌体方法及其药物组合物在组织修复中的应用。

技术介绍

[0002]外泌体于1983年首先由Harding等在大鼠的网织红细胞中发现，随后在1985年Pan等用电镜观察羊网织红细胞向成熟红细胞发育过程中同样发现了这种由细胞分泌的小囊泡，1987年Johnstone等将这种小囊泡正式定义为“exosomes”，即外泌体。起初外泌体被认为仅仅是细胞清除的一些不需要的细胞组分，直到2007年Valadi等人在外泌体中首次发现microRNA和mRNA等遗传物质，使得人们对外泌体的组成有了进一步的认识，同时人们也意识到外泌体可能是介导细胞间通讯的一种新机制，因此人们对外泌体的成分、形成机制、作用机制和功能进行了更深入的探索。
[0003]外泌体是早期内涵体向晚期内涵体/多泡体(multivesicularbody,MVBs)变化过程中由内涵体内陷形成的内囊泡(intraluminalvesicle,ILVs),内囊泡为亚细胞双层膜结构，其膜结构中富含鞘磷脂、胆固醇以及神经酰胺等成分，同时含有少量脂筏等，在外泌体的有些膜结构中还发现了磷脂酰丝氨酸等，而内囊泡形成时将一些特定的胞浆蛋白质、microRNA及mRNA,甚至包括一些小的可溶性生物因子，如趋化因子、生长因子、转录因子、细胞因子等纳入其中形成直径40
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100nm的封闭空间，当晚期内涵体/多泡体与细胞膜融合时，将内嚢泡即外泌体释放到细胞外基质中。因此，外泌体进入靶细胞的途径可以有两种：
①
通过细胞胞呑作用被撮入到细胞内；
②
通过膜融合的方式与靶细胞膜融合，进而直接释放其中含有的物质及信息到目的细胞。由于不同细胞分泌的外泌体所含的蛋白质和遗传物质不同，所以他们行使的生物学功能也有所不同。
[0004]多种疾病导致组织损伤，如心肌缺血再灌注损伤、脊髓损伤、神经元损伤、急性肾损伤、脑损伤、皮肤黏膜及血管内皮损伤、烧伤导致的皮肤损伤等，一直是高发病率、高死亡率最主要的原因。而治疗效果则不十分满意。如最常规的治疗烧伤的疗法—皮肤移植，其皮肤来源不仅有限，而且容易发生免疫排斥反应。尤其对于面部创伤所导致的一定面积瘢痕组织造成器官移位畸形，会给患者带来巨大的心理伤害。大量的证据表明外泌体外泌体是直径为30～100nm由各种组织细胞分泌的囊泡，来源广泛，基本上存在于所有生物体内。此外，其内含有丰富的mRNA、microRNA及蛋白质等成分，可以与靶细胞进行信息交流，促进细胞的增殖、迁移或抑制细胞的凋亡，进而达到促进组织损伤修复的目的。
[0005]脊髓损伤的病理生理学机制是很复杂的，包括细胞凋亡炎性反应、血管损伤、兴奋毒性、流体
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解质紊乱、线粒体功能障碍、钙和其他一些过程。其中凋亡和炎性反应是脊髓损伤继发性损伤的主要事件。细胞凋亡主要受上游Bcl
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2家族和下游caspase家族的调控，其中抗凋亡蛋白Bcl
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2和促凋亡蛋白Bax是细胞凋亡最常见的凋亡标志物。采用尾静脉注射的方式将100μg外泌体总蛋白植入到T10打击模型的脊髓损伤大鼠内，发现MSCs
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exosomes处理减少了脊髓损伤后大鼠脊髓中TUNEL阳性细胞的数量。同时，显著抑制促凋亡Bax水平，而
抗凋亡Bcl
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2水平上调。结果表明，MSCs
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exosomes在脊髓损伤中起着抗细胞凋亡的作用。
[0006]脊髓损伤后，血脑屏障受到损坏，受伤的脊髓可以迅速被来自血液的嗜中性粒细胞渗透。TNF
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α阳性和IL
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1β阳性细胞在脊髓损伤后脊髓周围区域强烈上调。TNF
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α和IL
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1β是重要的炎性介质，可加强脊髓中的神经细胞死亡。尾静脉注射MSCs
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exosomes可显著下调促炎性细胞因子(TNF
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α和IL
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1β)蛋白质水平和上调抗炎细胞因子(IL
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10)蛋白质水平，在脊髓损伤后发挥抗炎作用。天冬氨酸内肽酶抑制剂处理的脊髓损伤小鼠能够改善脊髓损伤的修复。
[0007]外泌体作为一种新的治疗策略，对于脊髓损伤的治疗展现出了一定的疗效。与移植MSCs相比，MSCs
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exosomes具有体内存活期更长、低致癌性、高传递效率的优势。外泌体不仅可以通过血脑屏障进入中枢神经系统，还可以通过基因修饰，提高治疗效率。虽然目前外泌体对于脊髓损伤治疗的直接报道还比较少，但是种种特征显示外泌体对于脊髓损伤的治疗研究前景很大。因此，研究外泌体用于组织损伤例如脊髓损伤变得尤为迫切。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于促进脊髓损伤修复的药物组合物，提供了一种血清提取外泌体的的制备方法，最终实现脊髓损伤功能的恢复。
[0009]本专利技术一方面，提供一种血清提取外泌体的方法，所述方法包括如下步骤：
[0010]取1mL血清，加入19mLPBS，300g，4℃离心10min。取上清转移到新的离心管中，2000g，4℃离心10min；取上清转移至新的离心管，在血清中加入8％PEG6000(2X)，具体配方为16gPEG6000+5.844gNaCl+100mL超纯水配制成8％PEG6000(2X)溶液；4℃静置孵育30min后，10000g，4℃离心1h，去除上清，用20mLPBS重悬，100000g，4℃离心70min，底部沉淀即外泌体。
[0011]本专利技术另外一方面，提供一种特异性针对天冬氨酸内肽酶的单克隆抗体，所述单克隆抗体为3C7单克隆抗体的序列如下所示。
[0012]轻链可变区(SEQ ID NO：1)：
[0013]DIVITQRPAMMAASPGEKVTITCRQFNMDKGFFWKWYQQKSGISPKPWIYMQCNQEQGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCCRGIPWQTCFGAGTKLELK
[0014]重链可变区(SEQ ID NO：2)：
[0015]EVQLEESATELSRPGASVKLSCKASGYIFSWDKQCWIKQRPGQGLEWIGWTRIHRFLRPKNHHLHGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGDKHDQTQWGLGTTLAVSS。
[0016]本专利技术一方面，提供一种药盒，所述药盒由外泌体、bFGF和单克隆抗体组成；所述药盒能够用于治疗脊髓损伤。其中，所述外泌体是采用如下方法制备获得：取1mL血清，加入19mLPBS，300g，4℃离心10min。取上清转移到新的离心管中，2000g，4℃离心10min；取上清转移至新的离心管，在血清中加入8％PEG6000(2X)，具体配方为16gPEG6000+5.844gNaCl+100mL超本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种药物组合，所述药物组合由外泌体、bFGF和单克隆抗体组成；所述组合用于治疗脊髓损伤；其中，所述外泌体是采用如下方法制备获得：取1mL血清，加入19mLPBS，300g，4℃离心10min；取上清转移到新的离心管中，2000g，4℃离心10min；取上清转移至新的离心管，在血清中加入8％2X PEG6000，具体配方为16gPEG6000+5.844gNaCl+100mL超纯水配制成8％2X PEG6000溶液；4℃静置孵育30min后，10000g，4℃离心1h，去除上清，用20mLPBS重悬，100000g，4℃离心70min，底部沉淀即外泌体；所述单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示；重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。2.外泌体、bFGF和单克隆抗体在制备用于治疗脊髓损伤的组合中的用途；其中，所述外泌体是采用如下方法制备获得：取1mL血清，加入19mLPBS，300g，4℃离心10min；取上清转移...

【专利技术属性】
技术研发人员：李少波，亓爱杰，
申请(专利权)人：诺赛联合北京生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：