用于植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR检测方法及试剂盒，该试剂盒由PCR反应酶预混液、菠萝泛菌特异性上游引物、下游引物、阳性对照以及阴性对照组成。本发明专利技术还提供了通过该试剂盒进行植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR检测的方法，该方法包含：步骤1，提取待测样品基因组DNA；步骤2，以步骤1所得的基因组DNA为模板，设定阳性标准品对照和阴性对照，与菠萝泛菌PCR反应液及特异性引物配制PCR反应体系，在优化的反应条件下进行荧光定量PCR反应。本发明专利技术在检测农作物及树木中的菠萝泛菌时，具有更高的特异性、敏感性和稳定性，是一种快速、准确的菠萝泛菌检测方法。准确的菠萝泛菌检测方法。准确的菠萝泛菌检测方法。

【技术实现步骤摘要】
用于植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种分子生物学领域的荧光定量PCR检测方法及试剂盒，具体地，涉及一种用于植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]植物致病菌菠萝菠萝泛菌(Pantoea ananatis)是革兰氏阴性菌，一种常见的附生植物。菠萝泛菌分布在世界各地，不仅能从植物中分离出来，也能从环境中分离出来。作为植物致病菌，对全世界范围内农作物和树木造成了大量的经济损失。它能够感染单子叶和双子叶植物，感染的不同宿主引起不同的症状，例如感染菠萝，哈密瓜等蜜瓜类会造成果实腐烂；感染玉米会造成坏死斑和条纹等；感染水稻会造成根茎秸秆腐烂等。感染桉树会造成叶枯萎病和芽尖枯死等。环境因素对不同宿主感染引起的疾病严重程度有不同影响。已经证实，菠萝泛菌(Pantoea ananatis)的病原体可以通过花粉、植物表面伤口以及在某一条件植物与植物的直接接触等一些方式进行传播。作为植物病原体，由于其发病速度快，病情严重，严重危害了部分地区的经济作物的生产。目前还没有快速准确检测Pantoea ananatis的方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种荧光定量PCR检测方法及试剂盒，用于对植物致病菌菠萝泛菌进行快速准确的检测。
[0004]为了达到上述目的，本专利技术提供了一种用于植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，所述的试剂盒由PCR反应酶预混液、菠萝泛菌特异性上游引物、下游引物、阳性对照以及阴性对照组成；所述的上游引物为TATCCGCGCCTTTGTTGAGT；所述的下游引物为 ATGCCGTCTTTCTCGGTTGA。
[0005]上述的用于植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，所述的阳性对照采用设计合成的阳性标准品序列，其为： 5
‑
TATCCGCGCCTTTGTTGAGTACCTGAATAAAAACAAAACGCCTATTCA CCCAACCGTATTCTATTTCTCAACCGAGAAAGACGGCAT
‑
3。
[0006]上述的用于植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，所述的阳性标准品序列，在使用时利用阳性标准品质粒稀释制备阳性标准品梯度，以达到定量的效果。
[0007]上述的用于植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，所述的阳性标准品梯度的制备过程为：取阳性标准品质粒10μl，按10倍梯度稀释，依次稀释4
‑
7个梯度，获得阳性标准品梯度。
[0008]上述的用于植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，所述的阳性标准品梯度制备完成后，再以梯度阳性标准品及样本DNA在相同条件下进行荧光定量PCR反应，以梯度阳性标准品的浓度对数值为纵坐标，实验结果Ct值为横坐标绘制标准曲线，根据样本测试得到的Ct值，计算获得样本中的菠萝泛菌的浓度。
[0009]本专利技术还提供了一种通过上述的试剂盒进行植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR
检测的方法，其中，所述的方法包含：步骤1，提取待测样品基因组DNA；步骤2，以步骤1所得的基因组DNA为模板，设定阳性标准品对照和阴性对照，与菠萝泛菌PCR反应液及特异性引物配制PCR反应体系，进行荧光定量PCR反应。
[0010]上述的进行植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR检测的方法，其中，所述的步骤2中的PCR反应体系浓度组成为：1XPCR缓冲液，上游引物和下游引物各0.2
‑
1μM，以及1
‑
10ng/μl的OD260/OD280在1.7
‑
1.9之间基因组 DNA模板。
[0011]上述的进行植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR检测的方法，其中，所述的步骤2中的PCR反应条件为：在95℃预变性30s，再在95℃变性5s，然后在60℃退火延伸30s，进行40个循环。
[0012]本专利技术提供的用于植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR检测方法及试剂盒具有以下优点：
[0013]本专利技术是针对菠萝泛菌的gyrB的基因序列，设计特异性引物研制出检测菠萝泛菌的试剂盒，gyrB基因其序列具有保守性和变异性，在以核苷酸序列为基础的细菌分类及鉴别研究中，可作为靶分子。以其为检测靶点设计的特异性引物通过荧光定量PCR技术检测菠萝泛菌，在检测农作物及树木中的菠萝泛菌时，具有更高的特异性、敏感性和稳定性，是一种快速、准确的菠萝泛菌检测方法。
附图说明
[0014]图1为PCR扩增的梯度标准品扩增曲线图。
[0015]图2为PCR扩增的熔解曲线图。
[0016]图3为PCR扩增的标准曲线图。
[0017]图4为梯度荧光定量PCR检测的结果曲线图。
[0018]图5为取10^9拷贝/μl，10^7拷贝/μl，10^5拷贝/μl，10^3拷贝/μl的电泳结果图。
具体实施方式
[0019]以下结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步地说明。
[0020]该试剂盒由PCR反应酶预混液、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)特异性上游引物、下游引物、阳性对照以及阴性对照组成。
[0021]其中，根据菠萝泛菌gyrB基因序列(GenBank登录号：MW981333.1) 设计并合成特异性引物，其序列如下：
[0022]上游引物为TATCCGCGCCTTTGTTGAGT(序列1)。
[0023]下游引物为ATGCCGTCTTTCTCGGTTGA(序列2)。
[0024]阳性对照采用设计合成的阳性标准品序列，其为： 5
‑
TATCCGCGCCTTTGTTGAGTACCTGAATAAAAACAAAACGCCTATTCA CCCAACCGTATTCTATTTCTCAACCGAGAAAGACGGCAT
‑
3(序列3)。
[0025]阳性标准品序列在使用时利用阳性标准品质粒稀释制备阳性标准品梯度，以达到定量的效果。
[0026]阳性标准品梯度的制备过程为：取阳性标准品质粒10μl，按10倍梯度稀释，依次稀释4
‑
7个梯度，获得阳性标准品梯度。
[0027]阳性标准品梯度制备完成后，再以梯度阳性标准品及样本DNA在相同条件下进行
荧光定量PCR反应，以梯度阳性标准品的浓度对数值为纵坐标，实验结果Ct值为横坐标绘制标准曲线，根据样本测试得到的Ct值，计算获得样本中的菠萝泛菌的浓度。
[0028]本专利技术还提供了通过该试剂盒进行植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量 PCR检测的方法，该方法包含：步骤1，提取待测样品基因组DNA；步骤2，以步骤1所得的基因组DNA为模板，设定阳性标准品对照和阴性对照，与菠萝泛菌PCR反应液及特异性引物配制PCR反应体系，在优化的反应条件下进行荧光定量PCR反应。
[0029]步骤2中的PCR反应体系浓度组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒由PCR反应酶预混液、菠萝泛菌特异性上游引物、下游引物、阳性对照以及阴性对照组成；所述的上游引物为TATCCGCGCCTTTGTTGAGT；所述的下游引物为ATGCCGTCTTTCTCGGTTGA。2.如权利要求1所述的用于植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照采用设计合成的阳性标准品序列，其为：5
‑
TATCCGCGCCTTTGTTGAGTACCTGAATAAAAACAAAACGCCTATTCACCCAACCGTATTCTATTTCTCAACCGAGAAAGACGGCAT
‑
3。3.如权利要求2所述的用于植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性标准品序列，在使用时利用阳性标准品质粒稀释制备阳性标准品梯度，以达到定量的效果。4.如权利要求3所述的用于植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性标准品梯度的制备过程为：取阳性标准品质粒10μl，按10倍梯度稀释，依次稀释4
‑
7个梯度，获得阳性标准品梯度。5.如权利要求4所述的用于植物致病菌菠萝泛菌的荧光定量PCR检测试...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈美娟，陈成成，陈冲，曹琴琴，杨敏，陆梦娇，王振球，章进军，贾俊才，
申请(专利权)人：上海沃吉基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：