同时检测幽门螺旋杆菌耐药位点、毒力基因分型及质子泵抑制剂代谢基因分型的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了同时检测幽门螺旋杆菌耐药位点、毒力基因分型及质子泵抑制剂代谢基因分型的试剂盒，具体的本发明专利技术基于多重PCR

【技术实现步骤摘要】
同时检测幽门螺旋杆菌耐药位点、毒力基因分型及质子泵抑制剂代谢基因分型的试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及同时检测幽门螺旋杆菌耐药位点、毒力基因分型及质子泵抑制剂类药物代谢基因分型的试剂盒。

技术介绍

[0002]幽门螺杆菌(H.pylori)是定植于胃上皮细胞的微需氧革兰氏阴性细菌，感染了世界约50％至70％的人口，有些发展中国家感染率甚至高达80％以上，是全球最普遍的病原体之一，可导致胃肠道疾病，包括消化性溃疡、胃边缘区/黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤和胃癌。幽门螺杆菌已被世界卫生组织和国际癌症研究机构(IARC)定为I类致癌物。据统计，全世界超过6％的癌症和大约90％的非贲门型胃癌病例均归因于幽门螺杆菌感染。根据世界卫生组织(WHO)资料，2018年因感染引发的癌症占24.2％，其中45％归因为HP感染。根除幽门螺杆菌将显着降低胃癌和消化性溃疡的发生率，并降低与控制这些发病率相关的成本，尤其在高流行人群中，根除幽门螺杆菌具有明显成本效益。目前，幽门螺杆菌的根除方案主要包括质子泵抑制剂(PPI)、胃粘膜保护剂和一种或两种抗生素，构成三联或四联疗法。用于根除幽门螺杆菌的抗生素包括克拉霉素、甲硝唑、喹诺酮类(左氧氟沙星)、阿莫西林、四环素、利福平等。在1990年代初，根除幽门螺杆菌的比率超过80％。但是近年来，随着全球幽门螺杆菌菌株对最常用抗生素的细菌耐药性不断增加，在过去20年中，许多国家的抗生素耐药性已超过15
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20％的门槛，克拉霉素、阿莫西林和甲硝唑的耐药性水平最高分别达50％、30％和95％。多药耐药性的出现显著影响幽门螺杆菌根除标准疗法的疗效，导致幽门螺杆菌的根除率在全球范围内不断下降。为了最好地优化幽门螺杆菌感染的管理，幽门螺杆菌的治疗应基于局部和个体抗菌素耐药性模式，针对具体患者量身定制有效的抗生素治疗策略可能会大大减少治疗失败并降低抗生素耐药性。
[0003]另一方面，并不是所有幽门螺杆菌阳性患者都推荐进行根除治疗，过度治疗会造成医疗资源的浪费、造成人群耐药比率的增加，而且抗生素使用还能产生的肠道菌群紊乱的风险。大量研究表明CagA和VacA为幽门螺杆菌的主要毒力因子，CagA分为阳性和阴性，其中阳性毒力大于阴性，VacA基因根据信号区(S区)和中间区(M区)基因序列的差异，可以分为s1/m1、s1/m2、s2/m1、s2/m2四种型，毒力程度可以按照s1/m1>s1/m2>s2/m1>s2/m2的顺序依次减弱。流行病学调查显示，vacA s1/m1型与cagA阳性显著相关，vacA s1/m1和cagA阳性菌株与胃溃疡，胃癌的发生显著相关。因此我们可以根据毒力基因检测结果，结合临床症状及医生的建议来决定是否进行HP根除治疗，给予医生有力的判断依据。
[0004]质子泵抑制剂(proton pump inhibitors,PPIs)作为目前抑酸性作用最强的一类药物，特异性高、持续时间长久，广泛应用于消化系统疾病治疗。但是对PPI不良反应认识的不足导致目前全球PPI滥用。由于用药的个体间差异大，PPI的使用受到约束。PPI的生物利用度和代谢主要受药物代谢酶CYP2C19的影响。CYP2C19编码基因的突变，可造成CYP2C19酶代谢活性的改变，进而出现不同患者服用以CYP2C19为关键代谢酶的药物后，体内血药浓度
差异，甚至产生不同临床反应。目前，发现的CYP2C19等位基因超过38个，但是在药物代谢中起作用的主要是CYP2C19*2、CYP2C19*3，其均为功能缺失型等位基因。另外，CYP2C19*17也在PPI代谢过程中起到些微作用，其他等位基因发生突变的概率极小。CYP2C19同工酶被分为四种不同的代谢类型：超快代谢型(ultrarapid metabolizers,UM)(*1/*17,*17/*17),可能由于功能区基因的非正常复制或非正常扩增造成酶活性明显增高；快代谢型(extensive metabolizer,EM)(*1/*1),功能区基因正常表达,表达正常活性酶，EM也是正常人群的代谢表型；中间代谢型(intermediatemetabolizer,IM)(*1/*2,*1/*3,*17/*2,*17/*3)，可能携带有一个功能缺陷的等位基因或无功能的等位基因，表达的药物代谢酶的活性较正常稍有降低；慢代谢型(poor metabolizer,PM)(*2/*2,*2/*3,*3/*3)，可能携带有两个无效的等位基因,致使表达的药物代谢酶的活性显著降低。PM型的同工酶基因出现突变，产生终止密码，使蛋白合成过早终止，从而产生无活CYP2C19酶，失去对物质的羟化代谢能力。所以，对CYP2C19进行基因分型检测，能够指导医生对PPI类药物进行精准剂量使用。
[0005]在耐药性检测方面，内窥镜引导的幽门螺杆菌培养和表型药敏试验(DST)是检测耐药性的金标准技术。但由于需要进行侵入式内窥镜检查才能从患者那里获得胃活检标本，并且幽门螺杆菌运输和培养均需要严格的条件，难度较大且很费时，至少需要10天才能完成细菌培养和抗生素敏感性测试，既费时又费钱，因此不建议在进行一线治疗之前进行完整的表型DST。随着分子检测技术的不断发展和完善，分子检测在病原微生物感染诊断及治疗监测上的临床应用日益广泛，可以作为培养法药敏试验的一种有效替代方法。目前常用的病原微生物分子检测方法主要包括：基于PCR的电泳法、实时荧光定量PCR(qPCR)、基因芯片技术、测序技术(Sanger测序技术、焦磷酸测序技术、高通量NGS测序技术)等。PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，具有灵敏度高、特异性强、简便快速、对标本的纯度要求低等特点，是目前应用最为广泛的病原学检测技术。目前用于确定幽门螺杆菌抗性的分子检测方法主要包括限制性片段长度多态性PCR(PCR
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RFLP)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、实时荧光定量PCR和等位基因特异性PCR等，检测样本包括活检标本、胃液、菌落甚至粪便，这些方法在检测23S rRNA和GyrA基因突变以预测克拉霉素和左氧氟沙星耐药性方面显示了良好的灵敏度和特异性。中国专利CN109797203A“幽门螺杆菌检测体系及检测试剂盒和应用”和CN111334592A“一种用于检测幽门螺杆菌耐药基因的核酸组合物及其试剂盒和应用”分别公开了用于幽门螺杆菌的鉴定、分型及抗生素耐药性的荧光定量PCR扩增体系，但是目前荧光定量PCR法由于本身的技术性限制，一个检测反应最多只能实现几个位点的同时检测，检测通量有限，当需要检测更多种基因变异点位时就会受到限制。另一方面，利用常规的荧光定量PCR方法可能无法满足大样本量快速检测的需求。中国专利CN105368825A“幽门螺杆菌抗生素耐药性分析试剂盒及耐药性检测方法”和CN105506160A“幽门螺杆菌定量和毒力多重基因检测体系及其试剂盒和应用”均公开了一种基于多重P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用多重PCR
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飞行时间质谱诊断幽门螺旋杆菌感染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一引物对组，所述第一引物对组包括序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.14所示的引物。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二引物对组，所述第二引物对组包括序列如SEQ ID NO.15至SEQ ID NO.30所示的引物。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第三引物对组，所述第三引物对组包括序列如SEQ ID NO.31至SEQ ID NO.48所示的引物。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第一探针组，所述第一探针组包括序列如SEQ ID NO.49至SEQ ID NO.55所示的探针。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二探针组，所述第二探针组包括序列如SEQ ID NO.56至SEQ ID NO.63所示的探针。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第三探针组，所述第三探针组包括序列如SEQ ID NO.64至SEQ ID NO.72所示的探针。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器、第二容器、第三容器、第四容器、第五容器、和第六容器，其中，所述第一容器内含有所述第一引物对组；所述第二容器内含有所述第二引物对组；所述第三容器内含有所述第三引物对组；所述第四容器内含有所述第一探针组；所述第五容器内含有所述第二探针组；所述第六容器内含有所述第三探针组。8.一种利用多重PCR
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飞行时间质谱检测幽门螺旋杆菌耐药位点的方法，所述方法包括步骤：(1)提供待测样本，对所述待测样本中的核酸进行PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物；(2)使用虾碱性磷酸酶(SAP)处理步骤(1)获得的扩增产物；(3)使用延伸探针对步骤(2)处理过的扩增产物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物；(4)纯化所述延伸产物；(5)采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(...

【专利技术属性】
技术研发人员：王冬，郭金海，王春香，
申请(专利权)人：江苏康为世纪生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：