一种婴儿配方奶粉及其加工过程中克罗诺杆菌的溯源方法组成比例

一种婴儿配方奶粉及其加工过程中克罗诺杆菌的溯源方法，属于食品安全技术领域。本发明专利技术利用MALDI

【技术实现步骤摘要】
一种婴儿配方奶粉及其加工过程中克罗诺杆菌的溯源方法


[0001]本专利技术属于食品安全
，具体涉及一种婴儿配方奶粉及其加工过程中克罗诺杆菌的溯源方法。

技术介绍

[0002]克罗诺杆菌(阪崎肠杆菌)是乳制品中新发现的一种条件致病菌，该菌在自然界分布广泛，繁殖迅速，对健康人群不产生危害，但对于免疫力低下者和婴幼儿、新生儿，尤其是早产儿、低体重儿可致病，由该菌引发的婴儿、早产儿败血症、脑膜炎及坏死性结肠炎的散发和暴发病例已在全球范围内陆续出现。已证实婴儿配方粉是主要的感染渠道。因此，对婴儿配方奶粉及其加工过程中克罗诺杆菌的溯源至关重要。
[0003]然而，现有的乳制品中菌株的溯源方法中应用的菌株鉴定及分型方法操作较为繁琐，需要的时间也较长，因此，寻找一种时效性强、操作简单且具有高通量特点的菌株鉴定分型方法对于婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的溯源具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术为了解决上述问题，本专利技术提供了一种一种婴儿配方奶粉及其加工过程中克罗诺杆菌的溯源方法，所述方法利用MALDI
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TOF MS或核糖体分型技术对采集自婴儿配方奶粉生产车间、参与婴儿配方奶粉生产的原辅料、中间品和成品的样品进行克罗诺杆菌的鉴定和分型，并将各样品的来源与各样品中克罗诺杆菌的分型情况建立联系，确定婴儿配方奶粉加工过程中最易污染克罗诺杆菌的关键环节和分布规律，从而追溯婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的来源。
[0005]在本专利技术的一种实施方式中，所述利用MALDI
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TOF MS进行克罗诺杆菌鉴定和分型的具体操作步骤如下：
[0006](1)从不同样品中得到克罗诺杆菌；
[0007](2)试验菌株的预处理：分别采用直接处理法、单一溶剂处理法和混合溶剂处理法对步骤(1)获得的克罗诺杆菌进行预处理；
[0008](3)设置仪器参数：氮气激光光源，激光波长370nm，线性正离子操作模式，基质抑制偏转模式，加速电压为20.00kv，延迟提取电压为18.25kv，设定质量范围为 1000
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12000Da，激光发射电压为2500mv，激光频率为30Hz；
[0009](4)点样：取1μL预处理好的克罗诺杆菌菌株样品点加在MALDI
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TOF MS专用的样品靶上，在室温条件下自然晾干，其上滴加1μL基质溶液覆盖，自然晾干后备用；
[0010](5)图谱采集与检测：输入样品信息后，机器进行采集；
[0011](6)数据的采集分析：采用MALDI
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TOF MS的数据采集软件FlexcontrolTM 3.0进行样品孔的数据采集，每株克罗诺杆菌平行3个样品孔，每孔取11个不同位置进行激光点击，采用MALDI
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TOF MS的鉴定软件Biotyper TM 2.0对形成图谱进行数据的匹配性分析；
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)所述直接处理法为用无菌棉签挑取平板上
的克罗诺杆菌单个菌落，涂布在MALDI
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TOF MS专用的样品靶上。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)所述单一溶剂处理法为用无菌棉棒挑取适量克罗诺杆菌放入1.5mL Eppendorf管里，先用0.2％的TFA洗2次，12000rpm/min离心2 min后，弃上清，向沉淀菌体加入50μL 0.2％的TFA，12000rpm/min离心2min后上清液转移到新Eppendorf管中备用。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)所述混合溶剂处理法为用无菌棉棒挑取适量克罗诺杆菌放入1.5mL Eppendorf管里，加300μl纯水混匀，再加入900μL无水乙醇混匀，12000r/min离心2min弃掉上清液，向Eppendorf管中加入50μL 70％FA和50μL ACN，离心后，取上清液转移到新Eppendorf管。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述利用核糖体分型技术进行克罗诺杆菌鉴定和分型的具体操作步骤如下：
[0016](1)从不同样品中得到克罗诺杆菌，并制备成菌液；
[0017](2)从各克罗诺杆菌的菌液中提取DNA；
[0018](3)用凝胶电泳将DNA片段按大小分开，再将这些片段转移并直接吸附在移动的尼龙膜上，经膜处理过程，形成数字化影像并存储，利用软件生成核糖体指纹图谱；
[0019](4)获得的核糖体指纹图谱经RiboprinterTM标准化后，使用BioNumefics数据库软件进行处理，识别图形条带，确定条带位置；聚类图使用非加权配对算数平均法构建，条带位置差异容许度和优化度分别设为1.00和0.50；
[0020](5)从RiboprinterTM细菌指纹图谱分析仪导出核糖体分型的文本文件，按照 BioNumerics软件的相关操作指南，依次建立数据库、安装Riboprinter输入程序、初始化数据库，最后导入相应的核糖体分型文本文件；在导入核糖体分型结果的基础上，录入试验菌株的相应背景信息，建立克罗诺杆菌的核糖体指纹图谱。
[0021]本专利技术的有益效果：
[0022]本专利技术通过对保留于不同时间段和不同区域婴儿配方粉中的菌株的分离和鉴定，鉴于MALDI
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TOF MS和核糖体分型技术在食源性致病菌检测方面的优势，对所有的克罗诺杆菌进行鉴定分型和聚类分析，从流行病学上寻找疾病传播途径和分析流行规律，建立我国乳制品中克罗诺杆菌菌株的质量指纹图谱，为进一步开展克罗诺杆菌溯源技术研究奠定基础。通过对乳粉生产企业环境的监测和终产品中致病菌的分离，鉴定和分型，系统的研究乳制品生产过程中阪崎克罗诺杆菌的污染分布情况，测定其生理特征或菌株残留存活的适应性调节机制，探知克罗诺杆菌属进入生产环境的途径和后续加工污染的途径，检测其存在的生态学小环境，分析其在完成生产加工过程中的传播途径，设计和执行改进的控制措施以弥补和强化现有的操作规范来尽可能消除克罗诺杆菌的污染，对于保障乳制品安全和指导乳制品生产具有重要意义。
附图说明
[0023]图1为ATCC29544在NA、TSA、VRBG和DFI显色培养基四种培养基上的质谱图；
[0024]图2为ATCC51329在NA、TSA、VRBG和DFI显色培养基四种培养基上的质谱图；
[0025]图3为75株克罗诺杆菌的MALDI
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TOF MS聚类分析图；
[0026]图4为ATCC29544的RiboPrinter鉴定图谱；
[0027]图5为75株C.sakazakii核糖体聚类分型鉴定树状图；
[0028]图6为同一工厂中环境分离株(平台ES65、U阀管ES60和固定床筛网ES66)与样品分离株ES24的MALDI
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TOF MS质谱图分析。
具体实施方式
[0029]以下结合具体实施例和附图，对本专利技术作进一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种婴儿配方奶粉及其加工过程中克罗诺杆菌的溯源方法，其特征在于，所述方法利用MALDI
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TOF MS或核糖体分型技术对采集自婴儿配方奶粉生产车间、参与婴儿配方奶粉生产的原辅料、中间品和成品的样品进行克罗诺杆菌的鉴定和分型，并将各样品的来源与各样品中克罗诺杆菌的分型情况建立联系，确定婴儿配方奶粉加工过程中最易污染克罗诺杆菌的关键环节和分布规律，从而追溯婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的来源。2.根据权利要求1所述的溯源方法，其特征在于，所述利用MALDI
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TOF MS进行克罗诺杆菌鉴定和分型的具体操作步骤如下：(1)从不同样品中得到克罗诺杆菌；(2)试验菌株的预处理：分别采用直接处理法、单一溶剂处理法和混合溶剂处理法对步骤(1)获得的克罗诺杆菌进行预处理；(3)设置仪器参数：氮气激光光源，激光波长370nm，线性正离子操作模式，基质抑制偏转模式，加速电压为20.00kv，延迟提取电压为18.25kv，设定质量范围为1000
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12000Da，激光发射电压为2500mv，激光频率为30Hz；(4)点样：取1μL预处理好的克罗诺杆菌菌株样品点加在MALDI
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TOF MS专用的样品靶上，在室温条件下自然晾干，其上滴加1μL基质溶液覆盖，自然晾干后备用；(5)图谱采集与检测：输入样品信息后，机器进行采集；(6)数据的采集分析：采用MALDI
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TOF MS的数据采集软件FlexcontrolTM 3.0进行样品孔的数据采集，每株克罗诺杆菌平行3个样品孔，每孔取11个不同位置进行激光点击，采用MALDI
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TOF MS的鉴定软件Biotyper TM 2.0对形成图谱进行数据的匹配性分析。3.根据权利要求2所述的溯源方法，其特征在于，步骤(2)所述直接处理法为用无菌棉签挑取平板上的克罗诺杆菌单个菌落，涂布在M...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜毓君，杨鑫焱，宋丹靓敏，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：