一种无载体蛋白质胞内递送前药及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种无载体蛋白质胞内递送前药及其制备方法与应用，为经由

【技术实现步骤摘要】
一种无载体蛋白质胞内递送前药及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及蛋白质修饰转运技术，更具体涉及蛋白质/多肽的递送体系，具体为一种无载体蛋白质胞内递送前药及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]蛋白质是一类重要的生物材料，其具有良好的生物相容性，多种蛋白质（如酶）还具有特殊的生物功能，因此有望于实现多种应用例如：癌症治疗、免疫治疗及生物成像等。绝大多数生物反应，都在胞内进行，胞内作用的蛋白质制剂具有广阔的应用前景。然而蛋白质分子量较大，不能穿过生物膜屏障，目前的蛋白质制剂多靶向胞外受体或结构域，这很大程度上限制了蛋白质制剂的应用。开发高效安全的蛋白质胞内递送系统，将功能性蛋白质递送进入功能异常细胞，实现细胞死亡或者功能恢复，同时减少正常细胞的毒副作用具有重要的意义。
[0003]目前蛋白质胞内递送方式多基于载体协助递送，这种递送方式存在着如下几个问题：1）为了实现较好的递送效果大多使用阳离子聚合物作为蛋白质载体，阳离子聚合物在血清中不稳定限制了其在体内的应用。2）载体协助递送的方式通过内吞途径进入细胞，绝大部分蛋白质被内涵体/溶酶体捕获，并在溶酶体中降解，只有极少数蛋白质进入胞质发挥功能。3）缺乏靶向功能，能够进入正常细胞中，产生毒副作用。4）载体与蛋白质的相互作用，可能破坏蛋白质的三维结构造成活性的丧失。5）载体在体内需要长时间降解，存在潜在的安全性问题。
[0004]因此亟需研发一种新型递送方式，能够克服上述障碍，将蛋白质安全、高效递送进入病灶细胞。

技术实现思路

[0005]本专利技术设计了一种无载体蛋白质递送系统，能够被肿瘤细胞识别并转运，可以直接将蛋白质递送进入胞质，避免内涵体/溶酶体包裹，使功能蛋白质活性得到保留，尤其是，可降低蛋白质递送系统在正常细胞中的毒副作用。解决了现有技术使用的蛋白质药物都是通过靶向细胞表面受体或者细胞外特定结构发挥功能的问题。
[0006]本专利技术首先由单体N与蛋白质赖氨酸残基的伯氨基团在碳酸氢钠溶液中发生反应，将N与蛋白质共价结合，得到N
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蛋白质；然后将N
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蛋白质与单体P反应将P结合到蛋白质上，得到PN
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蛋白质。PN
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蛋白质具有ROS响应性可在肿瘤细胞内高浓度的ROS条件下断裂，恢复原有蛋白质结构与活性。相关实验表明，这种无载体递送方式具有普适性，可递送多种电荷/分子量的蛋白质，并避免内涵体/溶酶体包裹，防止蛋白质降解。此外，本专利技术的蛋白质递送体系可准确识别肿瘤细胞，减少在正常细胞中的毒副作用，并在肿瘤细胞中高水平的ROS下，去除N修饰基团，促使蛋白质活性恢复，实现肿瘤细胞特异性杀伤。在4T1荷瘤小鼠模型中，使用尾静脉注射方式将毒素蛋白saporin前药（PN
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saporin）注入小鼠体内，成功抑制肿瘤生长并且显著延长小鼠生存期。
[0007]本专利技术采用如下技术方案：一种无载体蛋白质胞内递送前药，其结构为D
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N
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P，其中结构D为蛋白质，结构N为与蛋白质共价连接的单体结构，结构P为与结构N共价连接的单体结构，为LAT1底物分子。优选的，结构N在肿瘤细胞内环境下，能够从结构D上掉落。
[0008]上述无载体蛋白质胞内递送前药的制备方法为，将单体N与蛋白质发生反应，得到N
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蛋白质；再将N
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蛋白质与单体P反应，得到无载体蛋白质胞内递送前药；其中单体N结构位于蛋白质D与单体P结构之间。
[0009]本专利技术中，单体N与蛋白质的伯氨基团的摩尔比为（1～20）∶1；单体P与蛋白质的伯氨基团的摩尔比为1∶（0.5～10）；优选的，单体N与蛋白质的伯氨基团的摩尔比为（2～15）∶1，单体P与蛋白质的伯氨基团的摩尔比为1∶（1～5）。
[0010]本专利技术中，单体N一端为可以与蛋白质的伯氨基团发生反应的基团，比如硝基、炔基、羧基、琥珀酰胺基、醛基、环氧基团等；N
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蛋白质的N端为可以与单体P反应的基团；单体N与蛋白质的反应在溶液中、室温下进行，得到N
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蛋白质；N
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蛋白质与单体P反应时，反应位点可以是单体N原始的端基，也可是单体N与蛋白质发生反应后，单体N原始的端基转化的基团。单体P一端为能够与N
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蛋白质的N端反应的基团。优选的，N
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蛋白质与单体P的反应在溶液中、室温下进行，因此单体N与单体P能够发生反应的一端没有特别限定，只要在水中、室温下能够反应即可。优选的，LAT1底物分子为L
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亮氨酸、L
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甲硫氨酸、L
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苯丙氨酸、L
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撷氨酸、L
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色氨酸、L
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酪氨酸、L
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异亮氨酸、L
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组氨酸等。
[0011]作为具体的例子，单体N为下式所示的结构之一：单体P为下式所示结构之一：本专利技术中，单体N与蛋白质的反应在溶液中、室温下进行，具体的，将单体N溶液与
蛋白质溶液混合后反应5～20小时，优选的，反应条件为在室温下反应8～15小时；反应结束后，透析，得到N
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蛋白质。蛋白质溶液中，溶剂为碱液，所述碱性溶液可以采用碱比如碳酸氢钠等无机碱配制。
[0012]本专利技术中，N
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蛋白质与单体P的反应条件为室温反应5～60分钟，优选的，N
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蛋白质与单体P的反应条件为室温反应15～30分钟；反应结束后，超滤，得到无载体蛋白质胞内递送前药，即PN
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蛋白质。作为一个优点，本专利技术N
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蛋白质与单体P的反应在水中进行，无需其他物质参与，保证了蛋白质前药的纯净。
[0013]本专利技术进一步公开了上述无载体蛋白质胞内递送前药在制备蛋白质药物或者抗肿瘤药物中的应用。
[0014]本专利技术中，蛋白质为毒性蛋白质、非毒性蛋白质或者酶，都是针对肿瘤细胞而言。
[0015]本专利技术的优势在于无载体蛋白质胞内递送前药无需内吞机制，直接将蛋白质递送进入胞质，免去了内涵体/溶酶体逃逸的环节，极大的保留了蛋白质的活性，与此同时由于使用简单的小分子对蛋白质进行修饰，其在血清中的稳定性远高于载体类递送方式。另外本专利技术可以将蛋白质准确递送进入肿瘤细胞中，并且在细胞外，小分子（结构N、结构P）可以将蛋白质的活性屏蔽，在细胞内环境下，结构N能够从结构D上掉落，比如在肿瘤细胞高水平的活性氧自由基（ROS）的条件下掉落恢复蛋白质活性，双重保险的存在使得对于正常细胞的毒副作用大幅度减少。
附图说明
[0016]图1 描述了N修饰以及H2O2脱保护后的蛋白质分子量的基质辅助激光解吸电离时间质谱（MALDI
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TOF）；图2 描述了LAT1介导的无载体递送系统递送不同修饰以及H2O2预处理的BSA
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FITC在HeLa细胞摄取本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无载体蛋白质胞内递送前药，其特征在于，所述无载体蛋白质胞内递送前药的结构为D
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N
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P，其中结构D为蛋白质，结构N为与蛋白质共价连接的单体结构，结构P为LAT1底物分子。2.根据权利要求1所述无载体蛋白质胞内递送前药，其特征在于，结构N在肿瘤细胞内环境下，能够从结构D上掉落；LAT1底物分子包括L
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亮氨酸、L
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甲硫氨酸、L
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苯丙氨酸、L
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撷氨酸、L
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色氨酸、L
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酪氨酸、L
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异亮氨酸或者L
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组氨酸。3.根据权利要求1所述无载体蛋白质胞内递送前药，其特征在于，所述无载体蛋白质胞内递送前药的制备方法为，将单体N与蛋白质发生反应，得到N
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蛋白质；再将N
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蛋白质与单体P反应，得到无载体蛋白质胞内递送前药。4.根据权利要求3所述无载体蛋白质胞内递送前药，其特征在于，单体N与蛋白质的伯氨基团的摩尔比为（1～20）∶1；单体P与蛋白质的伯氨基团的摩尔比为1∶（0.5～10）；单体N一端为...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷黎晨，赵子印，刘寻，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：