本发明专利技术公开了一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，包括以下步骤：(1)基质样品前处理；(2)蛋白质提取和纯化；(3)蛋白水解和(4)肽段样品纯化，最终酶解后的肽段样品经过纯化和冻干后，得到蛋白样品，在蛋白质提取和纯化步骤中，同时沉淀水相和有机相中蛋白含量，减少亲水性蛋白损失，本发明专利技术有效的解决了现有技术中亲水性的蛋白的损失，提高了蛋白质组样品中蛋白质丰富度；同时解决了目前宏蛋白质组学研究环境微生物样品重复性差导致的蛋白定性定量出现较大偏差的问题，提高了蛋白质鉴定的重现性。质鉴定的重现性。质鉴定的重现性。
【技术实现步骤摘要】
一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法
[0001]本专利技术涉及一种制备宏蛋白质组样品的方法，尤其涉及一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，属于蛋白组学领域。
技术介绍
[0002]随着近年来高分辨率质谱技术的飞速发展，蛋白质组学得以进步和广泛应用。一方面，相比于蛋白质印迹法和酶联免疫吸附法，蛋白质组学方法能够高通量地获得样品中成百上千种蛋白质的信息，而且能够应用于检测未知的蛋白物质。另一方面，相比基于DNA测序技术的基因组学和转录组学，基于高分辨率质谱技术的蛋白质组学更能直接反映特定条件下微生物群落的物种组成和功能特征。蛋白质组学涉及的步骤包括样品中总蛋白的提取和纯化，纯化蛋白的处理和酶解，超高效液相色谱和高分辨率质谱联用检测，蛋白质的搜库鉴定及后续生物信息学分析。
[0003]专利公开号为CN107167353B的申请公开了一种用于土壤宏蛋白组学研究的样品制备处理方法。该样品处理方法涉及到多步提取和纯化步骤如震荡破碎、超声、离心、冷丙酮沉淀和酶解等过程。另外，公开专利号为CN109810168A的申请公开了一种多级蛋白提取的方法用于提取土壤中的总蛋白。该方案涉及到分别用柠檬酸，十二烷基磺酸钠，柠檬酸蛋白提取液对土壤进行三次提取，然后利用Tris
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饱和酚进行液液萃取富集蛋白质。
[0004]现有方法涉及的步骤繁杂，且未考虑并解决环境基质中微生物蛋白质样品制备的重复性差的问题，经过有机相即饱和苯酚萃取后，提取蛋白时所用水相被直接舍弃，大部分亲水性的蛋白可能因此损失，造成最后蛋白鉴定结果的与实际蛋白量的偏差。
技术实现思路
[0005]专利技术目的：本专利技术通过提供一种制备环境基质中微生物宏蛋白质组样品的方法，有效的解决了现有技术中亲水性的蛋白的损失，提高蛋白质组样品中蛋白质丰富度；同时解决了目前宏蛋白质组学研究环境微生物样品重复性差导致的蛋白定性定量出现较大偏差的问题，提高蛋白质鉴定的重现性。
[0006]技术方案：本专利技术所述的蛋白质组样品的方法，包括以下步骤：
[0007](1)基质样品前处理：将基质样品在液氮中猝灭后，在液氮环境中加入研磨助剂研磨，得到粉末状基质样品，向所述粉末状基质样品中加入裂解液和提取液，并经过离心后，得到下层为有机相、上层为水相的分层混合液；
[0008](2)蛋白质提取和纯化：分别吸出所述步骤(1)中所述有机相和所述水相，并在所述有机相和所述水相中分别加入蛋白沉淀剂，所述蛋白沉淀剂用以将所述有机相和所述水相中的蛋白质沉淀，沉淀后的有机相和水相经过离心后，分离出沉淀A和沉淀B；混合沉淀A和沉淀B得到沉淀C；
[0009](3)蛋白水解：向所述步骤(2)中的所述沉淀C中加入蛋白溶解液进行蛋白溶解，经离心后，弃去沉淀，保留上清液，所述上清液中加入蛋白酶解液，得到酶解后的肽段样品；
[0010](4)肽段样品纯化：所述步骤(3)中酶解后的肽段样品经过纯化和冻干后，得到蛋白样品。
[0011]进一步地，在所述步骤(1)前还包括器材预钝化处理步骤，将制备蛋白质组样品所用的器材置于预钝化处理水溶液中，浸泡6
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12小时。
[0012]进一步地，所述预钝化处理水溶液，化学成分以物质量浓度计包括：吐温
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20：0.02
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0.10mol/L，月桂基硫酸铵：0.10
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0.50mol/L，十二烷基磺酸钠：0.05
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0.20mol/L，脱氧胆酸：10
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30m mol/L。
[0013]所述器材具体指与所述基质样品直接接触的器材，包括离心管、枪头、药匙等；利用所述预钝化处理水溶液中表面活性剂的作用，来减少器材对基质样品中蛋白的吸附。
[0014]进一步地，所述步骤(2)中的所述蛋白沉淀剂为醋酸铵甲醇溶液。
[0015]进一步地，所述步骤(1)中，其中所述研磨助剂的加入质量为所述基质样品质量的10％
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30％，所述研磨助剂为聚乙烯基聚吡咯烷酮粉末。
[0016]进一步地，所述裂解液为pH＝6.5
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8.5的50
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200m mol/L Tris和0.05
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0.20mol/L SDS溶液；所述提取液为pH＝7.0
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9.0的Tris饱和苯酚。
[0017]进一步地，所述步骤(2)中，在向所述有机相和所述水相中分别加入所述蛋白沉淀剂前，还包括有机相纯化过程，向所述有机相中加入等体积质谱级超纯水，经过慢速涡旋振荡和离心后，得到纯化后的有机相。
[0018]进一步地，所述步骤(3)中，所述蛋白溶解液的各组分浓度为：三乙基碳酸氢铵为0.1
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0.5mol/L，二硫苏糖醇为8
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12mol/L和尿素为5
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8mol/L。
[0019]进一步地，所述步骤(3)中，所述蛋白酶解液包括蛋白酶解辅助液和蛋白酶解作用液。
[0020]进一步地，所述蛋白酶解辅助液为蛋白酶水解促进剂DCA。
[0021]DCA在蛋白酶解中起到了补偿了因环境基质和提取试剂中存在的干扰物质和蛋白变性剂对蛋白酶活的抑制作用。
[0022]蛋白酶水解促进剂DCA对蛋白酶水解具有促进作用，主要是由于蛋白酶对干扰物质的无效吸附将导致蛋白酶失活，DCA可以有效降低这种失活，促进蛋白酶与蛋白质的特异性结合；DCA加强了蛋白酶构型的严密性，进而提高对蛋白质的选择性；此外，DCA对疏水蛋白质具有促进溶解性和反应活性的作用，这也提高了其对蛋白酶水解的具有促进作用。
[0023]进一步地，蛋白酶解作用液包括二硫苏糖醇、碘乙酰胺、碳酸氢铵和胰蛋白酶，向所述步骤(3)上清液中加入蛋白酶解作用液的次序是：二硫苏糖醇、碘乙酰胺、碳酸氢铵、胰蛋白酶，或者所述碳酸氢铵和所述胰蛋白酶也可以同时加入。
[0024]有益效果：本专利技术与现有技术相比，其显著技术效果是：
[0025]1、有效解决了现有技术蛋白质提取和纯化阶段中亲水性的蛋白的损失，进而提高了蛋白质组样品中蛋白质丰富度。
[0026]2、极大地减少了因非特异性吸附导致的蛋白样品随机性损失。经试验测定，相比未处理过的介质，预钝化的介质能够提升约50％的蛋白回收量，极大地减少了导致重复性变差的蛋白质非特异性吸附。
[0027]3、显著提高了蛋白酶水解效率，减少了因肽段水解不充分导致的随机偏差。相比参考方法，最终鉴定到的独特蛋白质的数量提升了2
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3倍。
[0028]4、解决了目前宏蛋白质组学研究环境微生物样品重复性差导致的蛋白定性定量出现较大偏差的问题，蛋白质鉴定的重现性达到90％以上，且能获得高度一致的蛋白定量结果，线性回归R2值为0.95
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0.99，p值远小于0.001。
附图说明
[0029]图1是实施例1的聚丙烯酰胺凝胶电本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)基质样品前处理：将基质样品在液氮中猝灭后，在液氮环境中加入研磨助剂研磨，得到粉末状基质样品，向所述粉末状基质样品中加入裂解液和提取液，并经过离心后，得到下层为有机相、上层为水相的分层混合液；(2)蛋白质提取和纯化：分别吸出所述步骤(1)中所述有机相和所述水相，并在所述有机相和所述水相中分别加入蛋白沉淀剂，所述蛋白沉淀剂用以将所述有机相和所述水相中的蛋白质沉淀，沉淀后的有机相和水相经过离心后，分离出沉淀A和沉淀B；混合沉淀A和沉淀B得到沉淀C；(3)蛋白水解：向所述步骤(2)中的所述沉淀C中加入蛋白溶解液进行蛋白溶解，经离心后，弃去沉淀，保留上清液，所述上清液中加入蛋白酶解液，得到酶解后的肽段样品；(4)肽段样品纯化：所述步骤(3)中酶解后的肽段样品经过纯化和冻干后，得到蛋白样品。2.根据权利要求1所述的一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)前还包括器材预钝化处理步骤，将制备蛋白质组样品所用的器材置于预钝化处理水溶液中，浸泡6
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12小时。3.根据权利要求2所述的一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，其特征在于，所述预钝化处理水溶液，化学成分以物质量浓度计包括：吐温
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20：0.02
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0.10mol/L，月桂基硫酸铵：0.10
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0.50mol/L，十二烷基磺酸钠：0.05
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0.20mol/L，脱氧胆酸：10
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30m mol/L。4.根据权利要求1所述的一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的所述蛋白沉淀剂为醋酸铵甲醇溶液。5.根据权利要求1所述的一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)...
【专利技术属性】
技术研发人员：任洪强，林原，许柯，王黎晔，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：
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