本发明专利技术公开一种补气养血活性评价模型的建立方法，该方法包括斑马鱼节间血管生成模型的建立、斑马鱼红细胞生成模型的建立、斑马鱼免疫细胞生成模型的建立以及通过复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液的活性差异验证斑马鱼节间血管生成模型、斑马鱼红细胞生成模型以及斑马鱼免疫细胞生成模型的可靠性。本发明专利技术首次建立了以模式动物斑马鱼为基础的补气养血活性评价模型；首次以斑马鱼节间血管面积、斑马鱼尾部免疫细胞光密度为评价指标；首次以苯肼诱发斑马鱼贫血模型，以斑马鱼卵黄囊铁锈色沉淀面积为评价指标；首次通过复方阿胶浆以及不同配伍组合的中药提取液的活性差异验证三种斑马鱼评价模型的稳定可靠。更加科学、客观，提高了结果的准确性。提高了结果的准确性。
【技术实现步骤摘要】
一种补气养血活性评价模型的建立方法
[0001]本专利技术涉及一种补气养血活性评价模型的建立方法，并通过复方阿胶浆及其不同配伍的中药提取液验证该模型，属于中医药
技术介绍
[0002]中药是一个成份复杂的体系，具有多效应、多成分、多靶点的作用特性，通常以有效部位、提取物甚至水煎剂为研究对象，且部分成分需在体内转化才能发挥药理活性。目前对中药活性评价通常采用体外细胞或大鼠、小鼠等模式生物。体外细胞模型评价对环境要求较高，而且不能反映体内细胞的自然环境。这些缺陷限制了细胞筛选体系的应用。采用大鼠、小鼠等模式生物进行实验时，由于实验动物数量多、体型较大、占用空间、饲养不方便、实验周期长、观察不直接、难以同时满足对大量样品的活性和毒性评价、需要进行解剖才能观察器官生长情况，同样也存在诸多不便。近年来，随着动物实验3R原则(Reduction，Refinement，Replacement)的提出，各国对实验动物的使用进行了管制，更加限制了这些传统模式动物的大规模使用。
[0003]因此，有必要以一种新的模式生物弥补细胞培养和传统模式动物的不足。近年来，斑马鱼被越来越多的应用于中药活性和毒性研究。作为目前唯一适合高内涵、高通量、微孔板的脊椎动物模型，与常见的实验动物如大鼠、小鼠、兔子等相比，斑马鱼繁殖周期短，产卵数多，胚胎发育迅速，24h可完成体内器官的构建，且胚胎透明易于观察，适用于大规模的药物筛选。斑马鱼与人类基因具有同源性，可达87％。目前，不少学者证实斑马鱼活体动物实验比细胞实验准确率高，可以应用于化合物对复杂生命过程的影响观察，能更直观地评价药效、药毒等。在中医药研究中，斑马鱼模型发挥着重要作用。与细胞相比，斑马鱼对成分复杂的中药样品具有很好的适应性，可用于中药或方剂等复杂成分体系的药效评价及机制研究。
[0004]目前，斑马鱼被广泛用于心血管药物、调节血脂、保护肝功能、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗炎等多种活性药物的筛选和评价。近年来，对斑马鱼的应用也逐渐扩展到中药领域，研究对象包括传统的单味中药、中药复方、中成药。然而，由于中医证型复杂，有时仅凭单一的斑马鱼模型很难评价复杂中药体系的药效活性。以气血两虚证为例，中医认为气血是人体一切生命活动的物质基础，气血相互依存，相互滋生，两者在生理和病理上相互影响因果，研究时不能将两者完全区分开。关于气血两虚证的物质基础研究，中西医对于血的理解都是循行于经脉中的血液。“血虚”和“贫血”在概念上都是血液的减少；而中医学的“气”具有护卫肌表、抵御外邪侵入和驱除身体病邪的作用，与西医学的“免疫功能”相吻合。目前的研究也基本证实了血虚证和气虚证与机体造血功能和免疫功能有着密切的关系。
[0005]复方阿胶浆(FEJ)源自明代《景岳全书》中“两仪膏”，由动物药阿胶和四味植物药红参、熟地黄、党参、山楂组成。方中阿胶补血养血，为君药(A)；红参大补元气，熟地益精填髓，二者共为臣药(B)；党参补中益气，山楂活血行气，二者共为佐使药(C)。诸药合用，具有补气养血的功效。临床广泛用于气血两虚，头晕目眩，心悸失眠，食欲不振、白细胞减少症和
贫血等症，常用于癌症患者的治疗，能改善恶性肿瘤患者癌因性疲乏状态和体质。
[0006]针对斑马鱼在中药研究中的独特优势和复方阿胶浆的补气养血功效，本专利技术提供一种补气养血活性评价模型的建立方法，并通过复方阿胶浆及其不同配伍的中药提取液验证模型。其中，养血活性评价模型包括斑马鱼节间血管生成模型、斑马鱼红细胞生成模型，以斑马鱼节间血管面积、血红蛋白水平为评价指标；补气活性评价模型包括斑马鱼免疫细胞生成模型，以斑马鱼免疫细胞数量为评价指标。并以复方阿胶浆中不同配伍组合提取液(A、B、C、A+B、A+C、B+C)验证该模型。本专利技术首次建立斑马鱼补气养血活性评价模型，具有快速、稳定可靠和重复性好的优点。
技术实现思路
[0007]专利技术目的：本专利技术的目的是建立一种补气养血活性评价模型，并通过复方阿胶浆及其不同配伍的中药提取液验证该模型。为达到以上目的，本专利技术结合斑马鱼，建立斑马鱼节间血管生成模型、斑马鱼红细胞生成模型和斑马鱼免疫细胞生成模型，并通过复方阿胶浆及不同配伍的中药提取液的活性差异验证该模型的可靠性。本方法具有易于观察、快速、直接、真实准确等优势。
[0008]术语说明：尾静脉网对应的节间血管区域平均面积(Intersegmental vessels Average Area，IAA)：是指泄殖孔画垂直后主动脉(DA)的直线，直线尾尖侧的部分中，以DA为界，背侧为节间血管(Intersegmental vessels，ISV)区。图1中实线圈定的范围为IAA，箭头所指为ISV。
[0009]腹部卵黄囊区域铁锈色沉淀平均积分光密度(Rust
‑
colored Precipitates Integrated optical density，RPI)：是指仰面体位下幼鱼卵黄囊部位的铁锈色沉淀区域。图2中实线圈定的范围为卵黄囊，箭头所指为RPI。
[0010]尾部区域免疫细胞平均积分光密度(Immune Cells Integrated optical density，ICI)；是指泄殖孔画垂直DA的直线，直线至尾尖侧的部分中，为ICI区。图3中实线圈定的范围为ICI。
[0011]hpf(hours post fertilization)：生物学专用术语，指受精后的时间。如24hpf指受精后24小时的胚胎。
[0012]dpf(days post fertilization)：生物学专用术语，指受精后的天数。如1dpf指受精后1天的胚胎。
[0013]本专利技术的技术方案如下：(1)建立斑马鱼节间血管生成模型；(2)建立斑马鱼红细胞生成模型；(3)建立斑马鱼免疫细胞生成模型；(4)通过复方阿胶浆及不同配伍组合的中药提取液的活性差异验证斑马鱼节间血管生成模型、斑马鱼红细胞生成模型以及斑马鱼免疫细胞生成模型的可靠性。
[0014]本专利技术所述建立斑马鱼节间血管生成模型，步骤如下：(1)将受精后20
‑
24h的发育正常的斑马鱼胚胎移入培养孔中，设立空白溶剂对照组(Ctrl)、PTK787模型组(PTK787)及复方阿胶浆给药组(FEJ)；(2)麻醉孵育后的Ctrl组、PTK787组、FEJ组的每条斑马鱼，采集每条斑马鱼的荧光
显微图像，记录斑马鱼尾部血管荧光情况；(3)定量分析：测量每组斑马鱼的尾静脉网对应的IAA，以表示，分析比较各组差异的显著性；当Ctrl组斑马鱼的大于PTK787组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明造模成功；当FEJ组斑马鱼的大于PTK787组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(p＜0.05)，说明该浓度的FEJ对斑马鱼的血管生成具有促进作用。
[0015]根据本专利技术优选的，所述斑马鱼胚胎为血管荧光标记的转基因斑马鱼胚胎。血管荧光标记的转基因斑马鱼胚胎可采用本领域普通市售产品，本专利技术采用的血管荧光转基因斑马鱼Tg(f本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种补气养血活性评价模型的建立方法，包括养血活性评价模型和补气活性评价模型；包括如下步骤：所述模型动物为斑马鱼；所述养血活性评价模型包括斑马鱼节间血管生成模型、斑马鱼红细胞生成模型；所述补气活性评价模型包括斑马鱼免疫细胞生成模型。2.权利要求1所述的模型建立方法，其特征在于：(1)斑马鱼节间血管生成模型的建立：
①
将受精后20hpf
‑
24hpf的发育正常的斑马鱼移入24孔板中，将培养孔中的斑马鱼胚胎设置为空白对照组(Ctrl)、造模组(PTK787)；其中，空白溶剂组每孔加入2mL含有0.5％的DMSO溶液，PTK787组每孔加入2mL含有0.15μg
·
mL
‑1的PTK787溶液；
②
麻醉孵育后的斑马鱼胚胎，采集每条斑马鱼的显微图像，记录斑马鱼尾部血管荧光情况，测量每组斑马鱼尾部节间血管区域面积(IAA)；
③
定量分析：计算得到的每条斑马鱼IAA的相对面积以表示，分析比较Ctrl组、PTK787组之间差异的显著性；当PTK787组的大于Ctrl组的且达到统计学上的显著性水平(p<0.05)，说明已构建斑马鱼节间血管生成模型；(2)建立斑马鱼红细胞生成模型的建立：
①
将受精后48hpf的发育正常的斑马鱼移入24孔板中，将培养孔中的斑马鱼胚胎设置为空白对照组(Ctrl)、造模组(苯肼，PHZ)；其中，空白溶剂组每孔加入2mL含有0.1％的乙醇溶液，PHZ组每孔加入2mL含有0.175μg
·
mL
‑1的PHZ溶液；
②
用邻联茴香胺溶液染色孵育后的斑马鱼胚胎，采集每条斑马鱼的显微图像，记录斑马鱼腹部卵黄囊铁锈色沉淀情况，测量每组斑马鱼铁锈色沉淀区域面积(RPI)；
③
定量分析：计算得到的每条斑马鱼RPI的相对面积以表示，分析比较Ctrl组、PHZ组之间差异的显著性；当PHZ组的大于Ctrl组的且达到统计学上的显著性水平(p<0.05)，说明已构建斑马鱼红细胞生成模型；(3)建立斑马鱼免疫细胞生成模型的建立：
①
【专利技术属性】
技术研发人员：折改梅，李想，张云，夏青，于啊香，魏静，宋若兰，马嘉慕，姚鉴玲，单东杰，
申请(专利权)人：北京中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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