一种大规模悬浮培养禽腺病毒的方法技术

本发明专利技术提供一种大规模悬浮培养禽腺病毒的方法，所提供的方法可以获得高效价的Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型等禽腺病毒；所述的方法中使用的一种驯化的LMH细胞，为鸡肝癌悬浮LMH细胞，其保藏号为CCTCC NO：C2021202。本发明专利技术采用逐步降血清法将贴壁LMH细胞驯化为可稳定连续传代的悬浮细胞。然后用生物反应器全悬浮培养LMH细胞，然后逐级放大悬浮培养LMH细胞，并在悬浮细胞上分别接种增殖禽腺病毒抗原的方法，本发明专利技术方法可以获得高效价的禽腺病毒悬浮培养工艺病毒抗原，抗原效价是现行疫苗规程抗原效价的5～10倍左右。效价的5～10倍左右。效价的5～10倍左右。

【技术实现步骤摘要】
一种大规模悬浮培养禽腺病毒的方法


[0001]本专利技术属于病毒培养
，具体涉及一种大规模悬浮培养禽腺病毒的方法，即采用驯化的悬浮LMH细胞(鸡肝癌细胞)来悬浮培养禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型)的方法，包含有贴壁LMH细胞的悬浮驯化、悬浮细胞的培养及禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型)的悬浮培养放大的步骤。

技术介绍

[0002]在过去十几年中我国的禽腺病毒灭活疫苗主要经历了组织灭活疫苗、鸡胚灭活疫苗和细胞灭活疫苗。组织灭活疫苗是用感染鸡的肝脏匀浆经氯仿抽提和甲醛灭活制成的疫苗，该疫苗工艺简单粗放，根本不能应用于大规模生产而逐渐淘汰。鸡胚灭活疫苗采用SPF鸡胚接种腺病毒，收获尿囊液，灭活后制备成成品疫苗，该疫苗由于效价较低，成本较高也被放弃。鸡胚成纤维细胞灭活疫苗也因为工艺复杂，成本高，效价低也被淘汰。目前比较可行的是采用贴壁LMH细胞上进行培养，收获病毒液，灭活后制备成成品疫苗，但该工艺采用转瓶或者细胞工厂等传统的贴壁生产方式生产，存在工艺繁琐，效价不理想，依赖血清，劳动强度大，受到培养空间的限制而不能大规模放大。近几年，随着禽腺病毒疫病的频繁暴发，危害越来越严重，疫苗工作者迫切需要研究一种安全、高效的新型工艺，以替代现行的生产工艺。
[0003]因此，细胞悬浮培养技术成为目前值得发展的新兴技术，是一种新兴的大规模细胞培养技术，是大规模细胞培养的最理想模式，相较于贴壁细胞培养模式全悬浮细胞培养技术更易于放大，工艺简单快捷，大大降低成本，培养条件(温度、pH值、CO2浓度等)容易控制，并且培养过程系统化、自动化，不易被污染；另外全悬浮培养可作到无血清培养，动物成分大大降低，获得抗原效价高，不良反应小，可大大提高劳动生产效率，减少劳动强度等优势而备受青睐。
[0004]近几年禽腺病毒爆发频繁，造成危害比较大，对于该疫苗需求巨大，有几家疫苗厂家都在积极研发悬浮LMH细胞培养禽腺病毒工艺，均处在试验阶段。而本专利技术的方法是申请人所在的公司能够率先进行悬浮驯化LMH细胞，并放大培养至1500L反应器的厂家。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种大规模悬浮培养禽腺病毒的方法，所提供的方法可以获得高效价的禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型)悬浮培养工艺病毒抗原，达到或超过现行贴壁细胞规程的效价。
[0006]本专利技术首先提供一种驯化的LMH细胞，为鸡肝癌悬浮LMH细胞，于2021年8月4日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：C2021202。
[0007]所提供的驯化LMH细胞，是采用逐步降低培养基中血清含量来驯化获得的；
[0008]本专利技术还提供一种培养禽腺病毒的方法，是使用驯化的LMH细胞悬浮培养后，再扩增禽腺病毒；
[0009]所述的悬浮培养，是采用无血清培养基来悬浮培养LMH细胞；
[0010]所述的悬浮培养，其中培养基的体积为7L～1500L
[0011]所述的悬浮培养，其中的培养条件如下：接种密度在1.5
×
10
6.0
～2.0
×
10
6.0
个细胞/ml，温度为37℃、溶解氧值(DO)为40、pH值7.0
±
0.2条件下培养；当LMH细胞密度达到2.5
×
10
6.0
个细胞/ml时，将Ⅰ群4型/8b/D11/8a禽腺病毒生产用种毒按MOI＝0.2～1.0接毒，设定温度为37℃、溶解氧值(DO)为40、pH值7.2
±
0.2条件下进行病毒培养。
[0012]本专利技术采用逐步降血清法将贴壁LMH细胞驯化为可稳定连续传代的悬浮细胞。然后用生物反应器全悬浮培养LMH细胞，然后逐级放大悬浮培养LMH细胞，并在悬浮细胞上分别接种增殖禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型)病毒抗原的方法，本专利技术方法可以获得高效价的禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型)悬浮培养工艺病毒抗原，抗原效价是现行疫苗规程抗原效价的5～10倍左右。
附图说明
[0013]图1：LMH细胞的悬浮驯化流程图，
[0014]图2：悬浮LMH细胞照片图(200倍)，
[0015]图3：悬浮LMH细胞生长曲线图；
[0016]图4：悬浮培养禽腺病毒Ⅰ群4型和贴壁培养病毒液免疫抗体比较图；
[0017]图5：悬浮培养禽腺病毒8b、D11型和贴壁培养病毒液免疫抗体比较图。
具体实施方式
[0018]本专利技术采用生物反应器全悬浮培养LMH细胞增殖禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型)抗原的方法，与传统的贴壁细胞培养方法比较，该方法可以获得高效价的禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型)全悬浮细胞培养工艺病毒抗原，抗原效价是现行疫苗规程抗原效价的5倍左右；即半成品病毒含量不低于10
8.0
TCID
50
/0.1ml方可用于制苗(现有规程病毒含量不低于10
7.0
TCID
50
/0.1ml)。
[0019]本专利技术筛选的全悬浮LMH细胞是对来源于中国动物卫生与流行病学中心馈赠的贴壁LMH细胞,该细胞经过分子生物学改造优化，对禽腺病毒更加敏感。再基于此贴壁细胞经悬浮驯化筛选获得的；SF501全悬浮干粉培养基(专用于LMH悬浮细胞)购于上海倍谙基生物科技有限公司，货号FG0105701；DMEM(高糖)干粉培养基为Hyclone公司生产，货号：SH30045.05；胎牛血清为兰州百灵公司生产，货号：SA212.02；其他常用试剂均为国产分析纯试剂。
[0020]下面将结合实施例对专利技术作进一步说明。
[0021]实施例1：LMH细胞的驯化
[0022]采用生物反应器全悬浮培养LMH细胞增殖禽腺病毒(Ⅰ群4型、8b型、D11型、8a型)抗原的接毒流程：即全悬浮LMH细胞复苏和500ml摇瓶培养；小反应器(5L～25L)细胞培养、生物反应器细胞放大培养(100～1500L)、病毒接种、病毒液的收获灭活，并且半成品制备成多联灭活疫苗后免疫35日龄SPF鸡，分别测定21日和28日免疫抗体。
[0023]1、LMH细胞的悬浮驯化
[0024]用含10％的胎牛血清DMEM培养液复苏贴壁LMH细胞P3，生长致密后传代为P4。挑选
P4代生长良好的细胞，用含不同血清浓度DMEM培养液逐步适应培养。通过采用逐步降低血清含量的方法进行了悬浮培养细胞的驯化，方法如图1所示。
[0025]按照图1所示的方法悬浮驯化54代，成功的将中国动物卫生与流行病学中心馈赠的贴壁LMH细胞驯化成可在无血清条件下进行高密度悬浮培养的新型细胞株。将P54代确定为悬浮LMH细胞原始细胞第一代，即F1。
[0026]所筛选的细胞呈圆形，大小均一，悬浮均匀分布于培养液中，细胞间培养液清亮，细胞透亮，有轻微结团(图2)。该细胞对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种LMH细胞，其特征在于，所述的LMH细胞的保藏编号为CCTCC NO：V202158。2.如权利要求1所述的LMH细胞，其特征在于，所述的LMH细胞是采用逐步降低培养基中血清含量来驯化获得的。3.一种培养禽腺病毒的方法，其特征在于，所述的方法，是使用权利要求1所述的LMH细胞悬浮培养后，再扩增禽腺病毒。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的悬浮培养是采用无血清培养基来悬浮培养LMH细胞。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的悬浮培养，其中培养基的体积为7L～1500L。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的悬浮培养，其中培养条件如下：接种密度在1.5
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【专利技术属性】
技术研发人员：王玉红，韩建文，关秀春，李王强，刘岳，郑长虹，王鹏听，黄理进，贾建斌，贠鲁祥，黄新，李晓林，楚电峰，杜元钊，范根成，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：