褪黑素在直接抑制柯萨奇病毒B组3型药物制备中的应用制造技术

本申请公开了药物制备技术领域中褪黑素在直接抑制柯萨奇病毒B组3型药物制备中的应用，具体是通过对体外CVB3感染细胞模型实验进行研究，结果显示褪黑素能直接在基因水平抑制CVB3的复制，降低病毒滴度，证明褪黑素有明显的抗CVB3的作用，可用于制备抗CVB3的药物。可用于制备抗CVB3的药物。可用于制备抗CVB3的药物。

【技术实现步骤摘要】
褪黑素在直接抑制柯萨奇病毒B组3型药物制备中的应用


[0001]本专利技术涉及药物制备
，涉及褪黑素在直接抑制柯萨奇病毒B组3型药物制备中的应用。

技术介绍

[0002]病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VMC)指由嗜心性病毒感染引起的，以心肌细胞变性、坏死和间质炎性细胞浸润及纤维渗出为主要改变的心肌疾病，是临床最常见的感染性心肌病，可并发严重的心律失常、心力衰竭、心源性休克、猝死。其致病病原体主要是柯萨奇B组病毒(Coxsackieviruses group B，CVB)，在CVB的六个血清型中，CVB3具有强嗜心性。CVB3属于小核糖核酸病毒科肠道病毒，无包膜的单正链RNA病毒。感染患者中10％
‑
20％可进展至扩张性心肌病，少数重症患者可发生心力衰竭甚至死亡。目前临床对于病毒性心肌炎的治疗主要以改善左心功能不全的对症支持治疗为主，暂无特异性治疗的药物，均建议给予特异性抗病毒治疗。故不断发掘新的有效的抗CVB3药物，对病毒性心肌炎的治疗意义重要。
[0003]1959年，国外学者从牛松果体中分离出一种激素，因这种激素能使蛙背部皮肤褪色，故命名褪黑素(Melatonin，MT)，化学成分是N
‑
乙酰
‑5‑
甲氧基色胺。MT是一种广泛分布于植物、单细胞生物、藻类、细菌、无脊椎动物和脊椎动物中的内源性吲哚胺在人体内具有重要生理作用，如调节生物钟节律、调节代谢、抗氧化、调节生殖功能等。
[0004]目前有研究报道褪黑素可以减轻小鼠心肌损伤，但是其作用机理是下调小鼠心肌组织中凋亡指标Cleaved caspase3，Cleaved caspase9和Bax蛋白的表达，上调Bcl
‑
2蛋白的表达，从而对病毒性心肌炎小鼠起到保护作用，但是是否能抑制CVB3的复制，其并没有直接的相关性。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术的不足，提供褪黑素在制备抗柯萨奇病毒B组3型药物中的应用。
[0006]本专利技术的目的之一是提供褪黑素或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或赋形剂在制备抗柯萨奇病毒B组3型药物中的应用。
[0007]本专利技术的目的之二是提供褪黑素或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或赋形剂在制备抑制柯萨奇病毒B组3型复制的药物中的应用。
[0008]所述柯萨奇病毒B组3型感染所致的疾病包括：人类病毒性心肌炎、无菌性脑炎和新生儿全身性感染。
[0009]进一步的，所述褪黑素的抑制浓度为0.5～2mM。
[0010]本专利技术的目的之三是提供一种药物，褪黑素为活性成分制备的抗柯萨奇病毒B组3型药物。
[0011]本专利技术所述的褪黑素的分子式为：C
13
H
16
N2O2(可市购)。
[0012]本专利技术对上述分子式为C
13
H
16
N2O2的褪黑素进行了下述实验：
[0013]以CVB3感染的Hela(海拉)细胞为研究模型，检测褪黑素对CVB3感染后细胞病变效应(Cell cytopathic effect，CPE)的影响；对上清中病毒滴度的影响；对CVB3 mRNA的影响。检测结果显示，褪黑素能够在Hela细胞中抑制CVB3引起的CPE，降低病毒滴度，抑制CVB3 mRNA的转录水平。
[0014]实验结果证明，褪黑素具有明显的直接抗CVB3作用，可用于制备抗CVB3的药物。
附图说明
[0015]图1是用CCK8法检测褪黑素对Hela细胞增殖影响的示意图；
[0016]图2是在Hela细胞中观察褪黑素对CVB3引起CPE影响的示意图；
[0017]图3是用Reed
‑
Muench公式计算褪黑素作用于CVB3感染的Hela细胞后，病毒滴度变化的示意图；
[0018]图4是用荧光定量PCR法检测褪黑素作用于CVB3感染的Hela细胞后，对CVB3 mRNA转录水平的影响示意图。
具体实施方式
[0019]下面通过具体实施方式进一步详细说明：
[0020]1、CCK8筛选褪黑素作用Hela细胞最大无毒浓度
[0021]取处于对数生长期的Hela细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，将细胞接种于96孔板中，2
×
104个/孔，待细胞长满单层，弃去培养液，将不同浓度的褪黑素(0.25mM、0.5mM、1mM、2mM和4mM)加入96孔板中，每个稀释度接种5个孔为实验组，设5个孔只加培养基、细胞为实验对照组，另设5孔只加培养基作空白对照，每孔0.1mL。置于37℃，5％CO2培养箱中培养，培养24h后采用CCK8法测定OD值，计算细胞存活率。
[0022][0023]如图1所示，本专利技术用CCK8分析的方法检测药物对细胞生长的影响，采用CVB3特异性细胞模型Hela，选用的褪黑素浓度分别为0.25mM、0.5mM、1mM、2mM和4mM，实验数据进行单因素方差分析，结果显示浓度大于2mM的褪黑素对Hela细胞的增殖有明显的影响(p<0.05)。
[0024]2、在Hela细胞中观察褪黑素对CVB3引起CPE的影响
[0025]取处于对数生长期的Hela细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，将细胞接种于24孔板中，2
×
105个/孔，待细胞长满单层，弃去培养液，PBS清洗2
‑
3次，以MOI＝0.1的CVB3感染Hela细胞，2h后，吸出病毒液，替换为2％FBS培养基配置的含不同浓度褪黑素的培养基，同时设褪黑素单独给药组，CVB3感染组，阴性培养基对照组。17h后在光学显微镜下观察CPE。如图2所示，CPE是病毒在宿主细胞中复制后导致细胞内发生一系列变化，如：开始时，细胞核发生变化，染色质着边，核浓缩，随后细胞膜发生变化，失去黏附作用，细胞变圆，从培养瓶壁脱落，或细胞互相融合等。这些变化可通过光学显微镜检查。结果显示：和CVB3感染组相比，褪黑素浓度为0.5mM、1mM和2mM时能有效抑制CVB3引起的CPE，特别是2mM。
[0026]3、在Hela细胞中观察褪黑素对CVB3病毒滴度的影响
[0027]种板，接毒以及加药方式同2，加药17h后，收集细胞上清，4℃，12000rpm，离心
10min，再次收集细胞上清，备用。
[0028]取对数生长期的Vero细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，按照1
×
104个/mL的浓度接种于96孔板中，每孔100μL，待细胞长满单层，弃去培养液，用PBS清洗两遍，将收集的上清病毒液用DMEM高糖培养基依次10倍稀释(10
‑1～10
‑
10
)，每个稀释度接种8个孔，另设8孔作空白对照，只加无血清的DMEM高糖培养基，每孔0.1mL。置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每日观察并记录CPE情况，连续72h，用Reed...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.褪黑素或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或赋形剂在制备抗柯萨奇病毒B组3型药物中的应用。2.褪黑素或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或赋形剂在制备抑制柯萨奇病毒B组3型复制的药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：王欢，刘正芸，
申请(专利权)人：遵义医科大学，
类型：发明
国别省市：