一种含有活性肽并具有抗衰老作用的药品或化妆品制造技术

本发明专利技术涉及一种含有活性肽并具有抗衰老作用的药品或化妆品。本发明专利技术通过在培养干细胞时通过添加FGF和高氧条件下制备获得了高活性的干细胞外泌体，将所述外泌体负载具有抗氧化活性的活性肽之后，通过实验证实了所述负载多肽的外泌体具有促进皮肤成纤维细胞抗衰老的特性，通过小鼠实验也证明了所述外泌体能够提高皮肤的抗衰老性能，具有较好的市场应用价值。值。

【技术实现步骤摘要】
一种含有活性肽并具有抗衰老作用的药品或化妆品


[0001]本申请涉及生物医药领域，更具体的涉及一种含有活性肽并具有抗衰老作用的药品或化妆品。

技术介绍

[0002]衰老是机体各组织、器官功能随年龄增长而发生退行性变化的过程。衰老可以降低机体面对环境胁迫维持动态平衡的能力，从而增加机体患病和死亡的可能性。衰老与高血压、2型糖尿病、动脉粥样硬化、老年痴呆等疾病密切相关。机体衰老与组织再生性细胞减少、脏腑虚损、机体内自由基增加、机体中毒、饮食无节律等相关，是体内外许多因素(环境污染、精神紧张、遗传等)共同作用的结果。
[0003]衰老是不可逆的生命进程，最普遍的抗衰老方式是使用抗衰老药物。合成药物是用化学或生物方法制成的具有预防、治疗和诊断效果的物质，广泛应用于临床。目前临床上使用的延缓衰老药大多是合成药物，如维生素E可促进细胞分裂及抑制氧自由基生成、普鲁卡因制剂能延长细胞寿命、酰胺吡酮可延缓脑衰老等。而阿司匹林通过对抗氧化应激，延缓年龄相关的机体功能下降，从而延长线虫寿命；二甲双胍作为腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激活剂，也可改善认知障碍，对延缓衰老也有一定的作用。而PAL
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12、白藜芦醇类似物等药物的抗衰老作用则在近期颇受青睐。
[0004]目前，活性生物多肽具有安全稳定、易溶于水、易吸收、分子量小等优点，同时具有清除自由基、抗氧化、抗衰老等多种生物活性，不仅能够促进皮肤细胞的增殖，还可以为皮肤提供营养，延缓皮肤老化，促进皮肤创伤修复，因此被广泛应用于皮肤化妆品和抗衰老化妆品中。当今，因为社会老龄化程度加重以及消费者对年轻美丽的不断追求，抗衰老护肤品在化妆品市场中所占的比例也在逐年提升。消费者对抗衰老化妆品的安全性和有效性的需求也促进了对抗衰老化妆品的研究和开发技术的不断改进和完善。根据目前市场上已在售的抗衰老产品调查，已有多个国际知名品牌推出了肽类抗衰老化妆品，例如：玉兰油、雅芳、雅诗兰黛、兰蔻、欧莱雅、香奈儿、TheOrdinary、迪奥、SK
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等国际一线知名品牌，可谓掀起了肽类美容护肤品的热潮。
[0005]除此之外，外泌体用于皮肤抗衰老的研究也越来越多。外泌体(exosomes)是一种由细胞分泌的直径为40～150nm、密度范围为1.09～1.18g/ml的具有双层磷脂膜结构的囊泡样物质。目前已经从各物种、各类型的细胞培养上清中提取出了外泌体，如神经元细胞、间充质干细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨核细胞等。有研究表明，小鼠下丘脑神经干细胞(hypothalamicneuralstemcell，htNSC)的损耗，导致小鼠出现了衰老的症状以及生命周期缩短。向衰老小鼠脑室注射神经干细胞外泌体可以延缓脑衰老速度，延长小鼠寿命。研究还显示，外泌体携带的miRNA能够部分调节htNSC的抗老化效应，并在htNSC进入脑脊髓液后发挥相应作用。在皮肤抗衰老方面，韩国的Kim等研究发现，脐带间充质干细胞来源的外泌体可以轻易穿透角质层到达真皮，促进人皮肤组织Ⅰ型胶原和弹力蛋白的生成，改善皮肤质地。这些研究表明外泌体具有抗衰老应用前景。在早期发现机体衰老迹象方面，外泌体也有
其临床应用价值。唾液里有很多分子物质和微生物，可以作为局部或全身的有效生物指标，血液来源的分子会通过跨细胞或细胞旁路进入唾液腺进而影响唾液的组成成分。日本冈山大学研究人员推测唾液外泌体的miRNA可作为衰老的生物标记物。有研究对青年人群和老年人群的唾液外泌体进行miRNA的筛选和验证，发现miR
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3p的表达有显著差异，从而认为miR
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3p是一个新的衰老相关的生物标记物。此结果表明，唾液外泌体检测有希望作为一种标记衰老的手段。
[0006]虽然抗衰老机制和抗衰老药物的研究发展迅速，但研究还是不够深入，多数药物抗衰老效果不甚理想。临床直接用于治疗衰老的药物品种不多，还需进一步研究衰老分子机制、发掘抗衰老药物。

技术实现思路

[0007]本专利技术克服现有技术的缺陷，提供了一种抗衰老的化妆品。
[0008]本专利技术一方面，提供了一种源自高活性骨髓间充质干细胞的外泌体。
[0009]另外一方面，本专利技术还提供所述外泌体的制备方法，具体包括如下步骤：
[0010]取骨髓加等量PBS混匀，用针头沿管壁慢慢注入到1.073g/ml的Pereoll淋巴细胞分离液上，使之成为单细胞悬液，2000r/min离心30min。轻轻吸出中间呈白色浑浊状的骨髓间充质干细胞层，放入另一个离心管中，加入PBS，1500r/min离心15min，如此共洗3次。弃PBS，用含10％FCS的L
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DMEM培养液制成的细胞悬液进行计数板计数，以1X109/L的细胞数量接种于含青霉素、链霉素各10000U/100ml、含10％FCS的L
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DMEM培养液中。培养48h后第一次换液可见贴壁细胞变成梭形，细胞融合达到85％时传代接种于25ml 60
Co照射照射量5Gy处理后的细胞培养瓶中，置于5％CO2、37℃二氧化碳培养箱中培养；48h后首次换液，吸弃未贴壁的悬浮细胞，加入新鲜的含10％FCS的L
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DMEM培养液继续孵育，每3～4d换液。待贴壁细胞80％融合后，弃掉培养液，PBS冲洗瓶壁，0.25％胰酶消化，镜下观察控制2～3min，用含血清培养液终止消化，反复吹打瓶壁，制成单细胞悬液，按1X 109/L再次传代，至第三代时收获细胞；
[0011]将骨髓间充质干细胞使用无血清MSC培养基重悬，接种于底面积25cm2的培养皿中，接种细胞数1
×
106个，培养基20ml；细胞增殖到90％时用无菌PBS溶液清洗细胞表面，重复2次，加入20ml添加有5mg/L FGF的α
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MEM基础培养基在1％O2、3％CO2的培养条件下培养3d后收集培养上清进行外泌体提取；
[0012]将收集到细胞上清分别装于50ml离心管中，常温3500rpm，离心25min，去除细胞及其细胞碎片；收集离心后的上清，过0.22μm的滤过膜除去大的颗粒及囊泡，加入终浓度为5％的5
×
PEG 6000试剂，4℃静置过夜；将过夜静置的PEG 6000细胞上清混合液离心，3 000rpm离心30min，可见离心管底及壁上有白色絮状沉淀，将离心管上清弃去，并将离心管倒扣于吸水纸上，风干15min。按照1g:200mL的重量/体积比加入适量PBS重悬，再次5000rpm离心20min，弃上清，按照1g:100mL用PBS重悬即获得间充质干细胞外泌体。
[0013]本专利技术通过在培养干细胞时添加FGF以及在1％O2、3％CO2的培养条件下培养时，能够有效的促进外泌体产品的提高，制备得到的外泌体蛋白含量也得到显著的提高。
[0014]本专利技术另外一个方面，专利技术人前期从鲑鱼鱼皮中通过胶原蛋白水解工艺分离多肽组分鉴定并分离制备得到了2条抗氧化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗衰老的药物，其特征在于：所述药物含有负载有多肽的外泌体，并且是凝胶形式；其中外泌体的制备方法为将骨髓间充质干细胞使用无血清MSC培养基重悬，接种于底面积25cm2的培养皿中，接种细胞数1
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106个，培养基20ml；细胞增殖到90％时用无菌PBS溶液清洗细胞表面，重复2次，加入20ml添加有5mg/L FGF的α
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MEM基础培养基在1％O2、3％CO2的培养条件下培养3d后收集培养上清进行外泌体提取；将收集到细胞上清分别装于50ml离心管中，常温3500rpm，离心25min，去除细胞及其细胞碎片；收集离心后的上清，过0.22μm的滤过膜除去大的颗粒及囊泡，加入终浓度为5％的5
×
PEG 6000试剂，4℃静置过夜；将过夜静置的PEG 6000细胞上清混合液离心，3 000rpm离心30min，可见离心管底及壁上有白色絮状沉淀，将离心管上清弃去，并将离心管倒扣于吸水纸上，风干15min。按照1g:200mL的重量/体积比加入适量PBS重悬，再次5000rpm离心20min，弃上清，按照1g:100mL用PBS重悬即获得间充质干细胞外泌体；所述负载多肽的外泌体的制备方法为，在1mL 50mM海藻糖PBS溶液中分别加入外泌体100μg、1mg/mL SEQ ID NO:1DYT
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4多肽DMSO溶液20μl；混匀后，加入4mm电穿孔皿中，放入电穿孔仪，按照如下反应条件：电压120V，电容155μF，放电时间1ms，放电次数：2次；穿孔后即可将混悬液放入细胞培养箱中孵育1个小时，采用100000g超速离心两次，每次80min，小心弃尽上清，用PBS液重悬沉淀即为负载多肽外泌体；将所述负载多肽外泌体制备凝胶，所述凝胶的制备方法是按照如下配方采用本领域常规的制备方法来制备：0.65％的丙烯酸(酯)类/C10
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30烷醇丙烯酸酯交联聚合物(U
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21)，0.05％的EDTA二钠，3％的甘油，3％丁二醇，0.25％PHENONIP，1％负载有多肽的外泌体，4％分子透明质酸钠，然后用氢氧化钾10％溶液调节pH为5.6，余量为水。2.一种抗衰老的化妆品，其特征在于：所述化妆品含有负载有多肽的外泌体，并且是凝胶形式；其中外泌体的制备方法为将骨髓间充质干细胞使用无血清MSC培养基重悬，接种于底面积25cm2的培养皿中，接种细胞数1
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106个，培养基20ml；细胞增殖到90％时用无菌PBS溶液清洗细胞表面，重复2次，加入20ml添加有5mg/L FGF的α
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MEM基础培养基在1％O2、3％CO2的培养条件下培养3d后收集培养上清进行外泌体提取；将收集到细胞上清分别装于50ml离心管中，常温3500rpm，离心25min，去除细胞及其细胞碎片；收集离心后的上清，过0.22μm的滤过膜除去大的颗粒及囊泡，加入终浓度为5％的5
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PEG 6000试剂，4℃静置过夜；将过夜静置的PEG 6000细胞上清混合液离心，3 000rpm离心30min，可见离心管底及壁上有白色絮状沉淀，将离心管上清弃去，并将离心管倒扣于吸水纸上，风干15min。按照1g:200mL的重量/体积比加入适量PBS重悬，再次5000rpm离心20min，弃上清，按照1g:100mL用PBS重悬即获得间充质干细胞外泌体；所述负载多肽的外泌体的制备方法为，在1mL 50mM海藻糖PBS溶液中分别加入外泌体100μg、1mg/mL SEQ ID NO:1DYT
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4多肽DMSO溶液20μl；混匀后，加入4mm电穿孔皿中，放入电穿孔仪，按照如下反应条件：电压120V，电容155μF，放电时间1ms，放电次数：2次；穿孔后即可将混悬液放入细胞培养箱中孵育1个小时，采用100000g超速离心两次，每次80min，小心弃尽上清，用PBS液重悬沉淀即为负载多肽外泌体；将所述负载多肽外泌体制备凝胶，所述凝胶的制备方法是...

【专利技术属性】
技术研发人员：王京，张然，
申请(专利权)人：北京戴域生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：