一种脂肪间充质干细胞外泌体冻干粉制造技术

本发明专利技术涉及一种脂肪间充质干细胞外泌体冻干粉，本发明专利技术针对已有的抗冻蛋白进行设计和改构，获得了2个具有较好活性的抗冻蛋白突变体L11K和E17N，所述突变体可以较好的用于外泌体的冻干保护，制备的所述冻干粉具有极高的保护率以及促进成纤维细胞增殖的能力，对于皮肤疤痕愈合以及皮肤抗皱均具有较好的效果，前景较好。较好。

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪间充质干细胞外泌体冻干粉


[0001]本专利技术涉及一种改构的抗冻蛋白，更具体的涉及一种脂肪间充质干细胞外泌体冻干粉。

技术介绍

[0002]间充质干细胞属于多能干细胞，间充质干细胞有很多种类，目前能够从骨髓、脂肪、羊水、脐带血等组织中分离提取间充质干细胞，近年来，因其具有多分化潜能、免疫调节和自我复制及多种生物活性物质的分泌能力等特点而逐渐引起人们的关注，可作为理想的种子细胞用于组织器官的损伤修复以及皮肤美容化妆品的制备。
[0003]外泌体是一种脂质分子膜包裹的小囊泡，直径约为70～160nm。外泌体来源于细胞核内体系统，由多囊泡体内陷腔化形成并通过多囊泡体与细胞膜融合而释放到细胞外环境中。最早于1983年有研究人员发现了外泌体的释放，但直到发现外泌体转运包括microRNAs、功能性蛋白质等生物活性因子才激起了人们的兴趣。自此，对于外泌体研究的兴趣持续增加。研究方向包括了外泌体作为细胞间信号介质、疾病生物标志物、药物转运载体或者治疗的制剂。外泌体包括脂质、膜、胞质蛋白以及microRNA等物质。这些成分使得外泌体成为细胞间通讯的重要途径。外泌体是旁分泌的一个重要组成部分，它提供了一种非传统非接触的长距离细胞间通讯方式，越来越多的实验证实，间充质干细胞通过旁分泌外泌体，促进表皮细胞的迁移和生长。除此以外，外泌体还具有免疫抑制的功能，能调节免疫细胞中各种炎症因子的分泌如白细胞介素IL
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6/IL
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10、肿瘤坏死因子TNF等，而又因其半衰期较长，可考虑作为临床疾病的无创或微创诊断手段，有效减少患者的痛苦，也可很方便的用于制备化妆品用于美容。
[0004]正是基于外泌体的重要作用，分离制备以及保存外泌体变得尤为重要。实验室中常规的外泌体存储条件一般是4℃、
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20℃、
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80℃。在一项研究中，研究者评估了储存在4℃，
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20℃和
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80℃下长达28天的外泌体的稳定性，并将其与新鲜的外泌体进行了比较。研究者发现，与新鲜分离的外泌体相比，不同的存储温度和存储时间会影响外泌体的稳定性、大小分布和颗粒数量，并影响了外泌体的细胞吸收和生物分布。对于功能性研究，根据研究设计建议对新鲜分离的外泌体进行立刻分析或在4℃或
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20℃下短期保存后使用。但是对于长期保存用于治疗应用的外泌体，
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80℃存储条件将是更可取的。外泌体作为治疗试剂或药物递送载体有广泛的应用前景，但外泌体存储在
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80℃将不利于其运输及应用，因此还需要其他存储方法。冻干是一种已用于保存多种类型的生物材料(蛋白质，血浆、活细胞等)的技术。此外，冻干技术已被用于改善药物递送载体脂质体的长期稳定性。因此，冻干技术有可能改善外泌体的保存稳定性，如果冻干的外泌体可以在室温条件下稳定保存，外泌体的应用范围则将会大大提升。
[0005]目前，虽然外泌体冻干方法已经有一些，2016年Johnny等人从胶质瘤患者脑脊液中分离的外泌体，溶解于PBS缓冲液后进行冻干，外泌体冻干粉在室温中存放了7天后，发现外泌体颗粒数减少了37
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43％；2018年Elia等人在间充质干细胞外泌体中试生产中使用了
冻干技术，并针对冻干的外泌体进行了理化检测，冻干的外泌体较新鲜的外泌体活性有一定的改善；2018年Chonlada等人通过海藻糖作为冻存保护剂进行黑色素瘤外泌体冻干，在25℃条件下可以稳定保存4周时间。2019年Khairat等人使用海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮40(PVP40)作为干细胞外泌体的冻存保护剂，摸索两者之间的不同比例来寻找合适的保护剂最后在最优条件下可以保存8周而活性损失在20％。
[0006]在外泌体保存中，通常使用的主要是海藻糖和甘露醇。其中，海藻糖是蘑菇、虾、昆虫和细菌中所含的一种天然的非还原性的二糖。海藻糖被食品和化妆品工业广泛用作构造剂，稳定剂或保湿剂，并用作不稳定蛋白药物，疫苗和脂质体以及用于移植的细胞和器官的(低温)防腐剂。多项毒性研究确定了口服，胃或肠胃外给药后海藻糖在小鼠和人类中的安全性和耐受性。海藻糖为多种生物物质提供保护作用，包括稳定蛋白质，细胞膜和脂质体，减少冷冻过程中细胞内冰形成以及防止蛋白质聚集的能力。而甘露醇mannitol化学式为C6H
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O6，是一种糖醇，是山梨糖醇的同分异构体，易溶于水，为白色结晶性粉末，有类似蔗糖的甜味，常用的冻存保护剂。甘露醇不仅可作为优良的骨架剂使用，而且在一些处方中它能够兼作蛋白质的冻干保护剂。甘露醇对蛋白质的保护作用与其浓度、形态结构有关，而其浓度与结晶形态有时呈一定的关联性。通常认为无定型甘露醇具有使蛋白质稳定的作用而结晶态的甘露醇则失去保护功能；1％或更低浓度的甘露醇通过无定型结构的形成而阻止蛋白质药物的聚集，但是高浓度的甘露醇则易于形成结晶态而促进蛋白质药物的聚集。但是目前这二种组分在外泌体的冻干保存中效果还不是最理想的。
[0007]抗冻蛋白(antifreeze protein,AFP)是指能降低冰点和抑制冰晶生长的蛋白质,在鱼类、昆虫及植物中均有发现。不同来源的抗冻蛋白在结构或活性方面都存在很大的差异,但抗冻作用机理是一致的,即都是通过与冰晶结合影响冰晶的生长及形状发挥作用。采用抗冻蛋白来保护外泌体进行冻干是一个很有前景的研究方向。

技术实现思路

[0008]本专利技术在已有的抗冻蛋白GAPGAQGPPGLQGMPGERGAAGLP(24AA)的基础上，进行结构的改进和优化，即突变的方式，获得了改进型的抗冻蛋白，更适宜于外泌体冻干粉的制备。
[0009]如本文所用，“突变”是指多肽或蛋白中的氨基酸位置中的永久改变。突变包括取代、添加、插入和缺失。例如，氨基酸位置中的突变可为一种类型的氨基酸被另一类型的氨基酸取代(例如，丝氨酸(S)可被丙氨酸(A)取代；赖氨酸(L)可被苏氨酸(T)取代；等)。因而，多肽或蛋白质可具有一种或多种突变，其中一种氨基酸被另一氨基酸取代。
[0010]本专利技术的另外一方面，本公开提供一种抗冻蛋白变体，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:1的至少80％或至少90％序列同一性，其中所述变体包含在氨基酸位置11处的突变。更具体的，所述突变后的序列如SEQ ID NO:2所示，命名为L11K突变体。
[0011]一方面，本公开提供一种表达由本公开提供的L11K突变体的重组宿主细胞。在多个实施方案中，所述重组宿主细胞进一步表达L11K突变体多肽。另外，在多个实施方案中，当在含有碳源的培养基中培养时，所述重组宿主细胞产生L11K突变体。
[0012]另一方面，本公开提供一种包含本公开的重组宿主细胞的细胞培养物。
[0013]另一方面，本公开提供一种产生L11K突变体的方法，所述方法包括：(i)在碳源存在下培养本公开的重组宿主细胞或本公开的细胞培养物；和(ii)收集L11K突变体。
[0014]另外一方面，本专利技术提供一种SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种改构的抗冻蛋白，所述抗冻蛋白的序列如SEQ ID NO：2所示。2.权利要求1所述的抗冻蛋白在制备外泌体冻干粉的用途，其中，所述冻干粉的制备方法为：人间充质干细胞外泌体10g，加入1g份甘露糖醇、权利要求1中所述的抗冻蛋白，1g海藻糖，0.1g甘氨酸，混匀后，依次经0.45μm、0.22μm的微孔膜过滤后，液氮速度10min，随后在温度为
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【专利技术属性】
技术研发人员：王京，陈帅，
申请(专利权)人：北京戴域生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：