caspase抑制剂在制备干细胞冻干粉及抗衰老抗炎药物中的用途制造技术

本发明专利技术涉及caspase抑制剂在制备干细胞冻干粉及抗衰老抗炎药物中的用途。本发明专利技术提供了一种特异性的脂肪间充质干细胞冻干粉，所述冻干粉采用含有caspase

【技术实现步骤摘要】
caspase抑制剂在制备干细胞冻干粉及抗衰老抗炎药物中的用途


[0001]本专利技术涉及化妆品或者药物领域，更具体的涉及caspase抑制剂在制备干细胞冻干粉及抗衰老抗炎药物中的用途。

技术介绍

[0002]干细胞(stem cells,SC)是身体的起源细胞，是形成人体各组织、器官的始祖细胞，而且它可分化体内所有类型的细胞，例如：组织、器官、骨、软骨、肌腱、韧带等细胞，具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，学界称为“万用细胞”；干细胞疗法，通常包括自体脂肪干细胞或干细胞培养基，用于面部抗衰，实现皮肤的新生年轻化。
[0003]在美容行业，使用干细胞已经越来越流行。但是干细胞的保存一直是技术难题。目前临床使用的MSCs大多就是经体外培养、低温保存后的。但有研究显示用早期代数的MSCs的治疗效果要比晚期的效果好，这可能与MSCs的分化能力会随细胞的传代而降低有关。因此，MSCs的早期冻存是维持其移植时细胞状态和有效性的必要条件。
[0004]冷冻保存的目的是在液氮的低温环境下减缓细胞的代谢活动并维持生命.在细胞悬液的冷冻过程中，冰晶的形成是导致细胞死亡的主要原因之一。避免冰晶的形成就要保持冷却速率缓慢，以使冻存保护剂逐渐进入细胞内部形成浓度梯度。当冷却持续进行时，细胞内的水分在冻存剂的渗透压力下逐步流出细胞，当细胞内的冻存剂浓度达到最大时细胞就会完全脱水皱缩达到最佳冻存状态。如果冻存速率太快就不能让细胞内的水分完全出胞，从而导致细胞内的冰晶形成而对细胞造成损伤。但冻存液对细胞有一定毒性作用，冻存速率过低会导致细胞在冻存液中暴露的时间过长而导致细胞受毒.由冻存保护剂造成的细胞毒性和细胞内冰晶造成细胞损伤这两种冻存伤害已被广泛认同。
[0005]除了冷冻速率，冷冻保护剂也是减小冻存损伤需要考虑的重要因素之一。冷冻保护剂根据穿过细胞膜的能力被分为渗透性保护剂和非渗透保护剂。渗透性冷冻保护剂有二甲基亚砜、丙三醇、乙二醇、丙二醇、甲醇、乙醇、丙醇、甲酰胺等，主要作用是防止细胞内冰晶形成、避免高浓度冻存剂的毒性和使细胞在耐受度内脱水。渗透性保护剂的保护能力是由许多小分子构成的高溶解度的水溶性复合物，在高浓度下能够降低水的冰点，因此在冷冻过程中降低了大量冰晶的形成。非渗透性冷冻保护剂有海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、聚合物羟乙基淀粉和聚乙烯吡咯烷酮，它们能够在较低的浓度下保护细胞，但要求更高的冷冻速率.如聚合物羟乙基淀粉不能渗入导致细胞外的浓度增大，在低温下形成反渗透而脱水起到保护作用。换言之，非渗透性冷冻保护剂集中在细胞外导致细胞脱水主要是在冷冻的初始阶段。海藻糖的保护作用是和脂膜之间的相互作用，在冻存和复苏的过程中保持了蛋白质的稳定性，而且能够形成玻璃化基质抑制细胞内冰晶产生。但即便是非渗透性的保护剂，也是能引起细胞损伤的.所以研发最有效的冻存剂也是目前细胞冻存的挑战之一。现已有研究开始关注非渗透性保护剂对细胞的毒性机制，以期使其毒性降至
最低。
[0006]冻存过程中导致的损伤一般是由细胞在冷冻过程中脱水、氧自由基产生和细胞凋亡酶如caspase的激活所致.因此，有报道通过细胞的存活率、过氧化氢酶(抗氧化酶)和caspase的抑制剂，研究了能够稳定细胞膜的海藻糖对细胞的影响。研究表明用含2.5％、5％和10％的DMSO、60mmol/L海藻糖、100ug/mL过氧化氢酶和30ug/mL zVAD
‑
fmk(caspase抑制剂)的无血清冻存液在液氮中冻存羊水MSCs3周，结果显示，用2.5％DMSO和3种添加剂(海藻糖、过氧化氢酶和caspase抑制剂)的冻存液和含10％DMSO和30％FBS的冻存液，在群体倍增、细胞表面抗原表达和成肌细胞分化能力上表现相似，该结果证实了减少DMSO和无血清冻存对保持MSCs存活率和功能的可行性。
[0007]Caspase通常以无活性的酶原形式存在大多数后生动物细胞中,其家族成员在氨基酸序列、结构及酶的特性上均相似。该酶原是一个分子量为30
‑
50ku的单一多肽,由三个结构域构成,分别为N端前域、20ku的大亚基单位和10ku的小亚基单位。酶原分子被激活后,大小亚基解离并重新组装为四聚体形式的活性复合物,两个小亚基单位在中间,两个大亚基单位在外周,每个异二聚体包含一个催化位点。其中最重要的是执行型Caspase(ExecutionerCasepase),包括Caspase
‑
3、Caspase
‑
6、Caspase
‑
7等,其作用在于特异性地裂解底物使细胞发生生化及形态学改变,最终导致细胞凋亡。但是目前，caspase的抑制剂的类型还比较少，为本领域提供的选择还不够多，因此，开发新的caspase的抑制剂从而用于干细胞的冻干粉制备时本领域迫切的需求。

技术实现思路

[0008]本专利技术一方面，提供一种特异性针对Caspase
‑
7的单克隆抗体。所述抗体的轻重链可变区序列分别如SEQ ID NO:2和3所示。
[0009]另外一方面，本专利技术提供一种脂肪间充质干细胞冻干粉，所述冻干粉采用特定冻干剂来保护脂肪间充质干细胞而获得。
[0010]相应的，本专利技术提供一种冻干保护剂，所述冻干保护剂中含有Caspase
‑
7的单克隆抗体。
[0011]另外一方面，本专利技术的冻存保护剂组成为2％单克隆抗体、20％聚乙烯毗咯烷酮、25％海藻糖、20％丙三醇、5％蔗糖、10％甘露醇和0.5％多聚精氨酸，DMEM/F12培养液中溶解混匀。
[0012]另外一方面，本专利技术提供一种冻干脂肪间充质干细胞的方法，所述方法包括：收集第4代融合度为85％的脂肪间充质干细胞，用胰蛋白酶/EDTA消化液消化细胞，细胞变圆刚脱离培养板面时终止消化，用PBS清洗2遍，1000r/min，离心5min。离心后，取脂肪间充质干细胞与保护剂按体积比2：1混匀。先在4℃下平衡15min，然后快速置入
‑
80度低温冰箱冷冻2h。随后转移到预先冷却至
‑
60℃的冻干机搁板上，维持2h。冻结过程结束后，开启冷阱制冷阀使冷阱温度降至
‑
60℃以下，开启真空泵使冻干室真空度达到10Pa以下，关小搁板制冷阀使搁板温度升至
‑
35℃，维持一次干燥15h。此后，以0.2℃/min的加热速度使搁板温度升高至20℃并维持在此温度直到二次干燥过程结束，这个过程持续约12h。冻干结束后样品呈干饼状，无塌陷，将其严格密封后保存于4℃冰箱内。
[0013]进一步的，本专利技术提供一种上述方法制备的冻干脂肪间充质干细胞在制备美容产
品中的用途。其是通过促进成纤维细胞胶原蛋白等的分泌以及抑制凋亡实现的。
[0014]另外的一个方面，本专利技术的美容产品中还添加有抗氧化剂。
[0015]本专利技术所述的抗氧化剂包括：阿斯可比酸及二义盐类及衍生物，如：阿斯可比色氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脂肪间充质干细胞冻干粉在制备化妆品中的用途，所述冻干粉能够促进成纤维细胞的活性，延缓细胞衰老；其中，所述脂肪间充质干细胞冻干粉是将脂肪间充质干细胞与冻干保护剂混合后冻干制备到；所述冻干保护剂组成为2％单克隆抗体、20％聚乙烯毗咯烷酮、25％海藻糖、20％丙三醇、5％蔗糖、10％甘露醇和0.5％多聚精氨酸，DMEM/F12培养液中溶解混匀获得；所述单克隆抗体是Caspase
‑
7单克隆抗体2D5，其轻链可变区序列如SEQ ID NO:2所示，重链可变区序列如SEQ ID NO:3所示。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于其中化妆品中还添加有抗氧化剂。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于化妆品中还含有稳定剂，乳化剂，可溶化剂，颜料及香料等通常的助剂。4.一种脂肪间充质干细胞冻干粉在制备药物中的用途，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王京，陈帅，
申请(专利权)人：北京戴域生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：