基于γ-分泌酶激活蛋白基因的干燥综合征动物模型的建立方法技术

本发明专利技术公开了一种基于γ

【技术实现步骤摘要】
基于
γ
‑
分泌酶激活蛋白基因的干燥综合征动物模型的建立方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，尤其涉及一种基于γ
‑
分泌酶激活蛋白基因的干燥综合征动物模型的建立方法。

技术介绍

[0002]原发干燥综合征(pSS)是一种主要侵犯外分泌腺为主要特征的慢性炎症性自身免疫性疾病，在中医学方面，pSS属“燥证”、“燥病”等范畴，以口眼干燥为主症，随着疾病的进展，可造成多器官、多系统受累。pSS患病率为0.1％
‑
1％，仅次于类风湿关节炎居第二位，男女比例为1:9。其发病机制不明，pSS被认为是一个起源于遗传因素与能够触发异常自身免疫应答的外源性因素之间的相互作用而发病的多因素致病过程。在特定表观遗传因素，遗传易感性和激素调节作用下，触发外分泌腺上皮细胞(SGEC)功能失调，在pSS的发病中至关重要，是T淋巴细胞、B细胞过活跃和自身抗体产生的基础。既往的研究已将免疫应答基因的SNP与pSS易感性联系起来，两项全基因组关联研究进一步证实了免疫在pSS发育中的关键作用。但是已鉴定的基因的单核苷酸多态性(SNP)仅能解释对疾病的易感性。因为大多数都很常见，并且不会改变编码的蛋白质。且治疗手段非常有限，主要以人工唾液、人工泪液改善症状为主。
[0003]干燥综合征不仅起病隐蔽病程长,而且发病的病因病机尚无一个明确的定论,所以对该病的研究就显得异常的迫切。建立动物模型利用动物疾病模型来研究人类疾病，可以克服平时一些不易见到，而且不便于在病人身上进行实验的各种人类疾病的研究。同时还可克服人类疾病发生发展缓慢，潜伏期长，发病原因多样，经常伴有各种其它疾病等因素的干扰，可以用单一的病因，在短时间内复制出典型的动物疾病模型，对于研究人类各种疾病的发生、发展规律和防治疾病疗效的机理等是极为重要的手段和工具。但在实验室中对动物模型的建立又是对干燥综合征研究提出的另一个难题。干燥综合征的动物模型主要是鼠类,而大鼠的不经济性，建模成本高，所以小鼠模型较受欢迎。
[0004]前期我们发现了一个四代有五个发病的pSS家系，呈常染色体显性遗传。全基因组测序，经过变体过滤和分离分析确定为γ
‑
分泌酶激活蛋白基因(GSAP)基因中的p.Pro122Thr是唯一的候选变体。所有受影响的家庭成员均携带杂合突变的等位基因，而未受影响的成员具有野生型等位基因，公共变体数据库中也没有该变体。GSAP在阿尔茨海默病中发挥重要作用，但本家族未发现阿尔茨海默病病例。我们的研究首次确定了家族性pSS的致病性突变。
[0005]综上所述，现有技术存在的问题是：
[0006]目前研究用到的两种较为普遍的pSS模型为自发型和诱导型，均存在弊端。自发型动物模型往往是继发于另一种疾病而产生SS症状，对于其发病原因和病理生理机制的研究无法深入开展。如NOD小鼠常伴发1型糖尿病。诱导性鼠模型是指通过对正常的鼠做出一些相关的处理以诱导其产生局部的干燥综合征的症状。目前主要使用的诱导方法为注射同种
鼠或异种鼠的抗原或组织匀浆进行免疫；或用佐剂进行免疫；还有通过接种病毒进行诱导。一些诱导型小鼠，如干燥综合征抗原A诱导的pSS动物模型，造模周期较长，造模过程烦琐。

技术实现思路

[0007]专利技术目的：为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种基于γ
‑
分泌酶激活蛋白基因的干燥综合征动物模型的建立方法。
[0008]技术方案：为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0009]一种基于γ
‑
分泌酶激活蛋白基因的干燥综合征动物模型的建立方法：小鼠Gsap基因位于小鼠5号染色体上；其中共鉴定出31个外显子，ATG起始密码子位于外显子TGA终止密码子位于外显子31；突变位P118位于外显子5上；外显子5将被选为目标位点；
[0010]gRNA靶序列：gRNA1(与基因正向链匹配)：AATGACCTTCAGCCAGGTAATGG；通过同源性定向修复，将供体寡核苷酸P118T(CCA
‑
ACA)突变位点导入第5外显子；
[0011]采用crispr
‑
cas9基因编辑技术建立GSAP基因错义突变的小鼠模型，突变位点是P118T(CCA>ACA)。将小鼠Gsap基因的gRNA、含P118T(CCA
‑
to
‑
ACA)突变位点的供体寡核苷酸和cas9mRNA一起注射到受精卵中产生靶向敲除子代；用PCR方法鉴定F0代小鼠，并进行序列分析，将其育成野生型小鼠，进行种系传递和F1代动物的研究。
[0012]具体包括以下步骤：
[0013]步骤1：向预先准备好的雌鼠腹腔注射激素，注射激素分别为血促性素和人绒毛膜促性腺激素；
[0014]步骤1中向每只雌鼠注射注射血促性素的剂量为4.5
‑
5.5U,向每只雌鼠注射注射人绒毛膜促性腺激素的剂量为4.5
‑
5.5U,两次注射间隔42
‑
54h；
[0015]步骤2：在给药后,将注射激素后的雌鼠以及雄鼠处死,分别取出雌鼠的输卵管膨大部以及雄鼠的附睾；
[0016]步骤3：在体视显微镜下分别收集卵子和精子；
[0017]步骤4：使精子在获能液中获能,取液体边缘的精子滴加到短暂培养的卵细胞中,体外受精；
[0018]步骤5：将体外转录成功的sgRNA与Cas9mRNA分别用无RNA酶水稀释，得到稀释sgRNA溶液和稀释Cas9mRNA溶液,通过显微注射的方式将稀释sgRNA溶液和稀释Cas9mRNA溶液分别导入到小鼠受精卵细胞质中；
[0019]步骤6：将存活的受精卵移植到与结扎雄鼠合笼后见栓的ICR雌鼠输卵管膨大部,缝合；
[0020]步骤7：F0代鼠出生后6
‑
8天剪取小鼠脚趾并编号,使用动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取小鼠DNA；
[0021]步骤8：根据被编辑的序列位置设计鉴定用PCR扩增引物、基因敲除示意图及引物、PCR扩增体系及反应式；
[0022]步骤9：对PCR扩增产物进行T
‑
A克隆,并进行DNA测序；
[0023]步骤10：筛选出成功发生基因突变的阳性首建鼠与野生型小鼠进行交配；
[0024]步骤11：待F1代小鼠出生后,再次利用步骤8中的鉴定方法对敲除情况进行鉴定,筛选出敲除情况相同且性别不同的F1代小鼠进行近交；
[0025]步骤12：F2代小鼠继续进行基因型鉴定,以建立稳定遗传GSAP基因错位突变小鼠品系。
[0026]优选的：步骤7中提取小鼠DNA的方法为：
[0027]步骤71：剪取小鼠尾巴，每尾片大小为2
‑
5mm，每尾片加入170
‑
190μL缓冲液GL、15
‑
25μL蛋白酶K和5
‑
15μL核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于γ
‑
分泌酶激活蛋白基因的干燥综合征动物模型的建立方法，其特征在于：小鼠Gsap基因位于小鼠5号染色体上；其中共鉴定出31个外显子，ATG起始密码子位于外显子TGA终止密码子位于外显子31；突变位P118位于外显子5上；外显子5将被选为目标位点；与基因正向链匹配的gRNA靶序列：gRNA1：AATGACCTTCAGCCAGGTAATGG；通过同源性定向修复，将供体寡核苷酸P118T(CCA
‑
ACA)突变位点导入第5外显子；将小鼠Gsap基因的gRNA、含P118T(CCA
‑
to
‑
ACA)突变位点的供体寡核苷酸和cas9mRNA一起注射到受精卵中产生靶向敲除子代；用PCR方法鉴定F0代小鼠，并进行序列分析，将其育成野生型小鼠，进行种系传递和F1代动物的研究。2.根据权利要求1所述基于γ
‑
分泌酶激活蛋白基因的干燥综合征动物模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：向预先准备好的雌鼠腹腔注射激素，注射激素分别为血促性素和人绒毛膜促性腺激素；步骤1中向每只雌鼠注射注射血促性素的剂量为4.5
‑
5.5U,向每只雌鼠注射注射人绒毛膜促性腺激素的剂量为4.5
‑
5.5U,两次注射间隔42
‑
54h；步骤2：在给药后,将注射激素后的雌鼠以及雄鼠处死,分别取出雌鼠的输卵管膨大部以及雄鼠的附睾；步骤3：在体视显微镜下分别收集卵子和精子；步骤4：使精子在获能液中获能,取液体边缘的精子滴加到短暂培养的卵细胞中,体外受精；步骤5：将体外转录成功的sgRNA与Cas9mRNA分别用无RNA酶水稀释，得到稀释sgRNA溶液和稀释Cas9mRNA溶液,通过显微注射的方式将稀释sgRNA溶液和稀释Cas9mRNA溶液分别导入到小鼠受精卵细胞质中；步骤6：将存活的受精卵移植到与结扎雄鼠合笼后见栓的ICR雌鼠输卵管膨大部,缝合；步骤7：F0代鼠出生后6
‑
8天剪取小鼠脚趾并编号,使用动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取小鼠DNA；步骤8：根据被编辑的序列位置设计鉴定用PCR扩增引物、基因敲除示意图及引物、PCR扩增体系及反应式；步骤9：对PCR扩增产物进行T
‑
A克隆,并进行DNA测序；步骤10：筛选出成功发生基因突变的阳性首建鼠与野生型小鼠进行交配；步骤11：待F1代小鼠出生后,再次利用步骤8中的鉴定方法对敲除情况进行鉴定,筛选出敲除情况相同且性别不同的F1代小鼠进行近交；步骤12：F2代小鼠继续进行基因型鉴定,以建立稳定遗传GSAP基因错位突变小鼠品系。3.根据权利要求2所述基于γ
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾二涛，张剑勇，
申请(专利权)人：深圳市中医院，
类型：发明
国别省市：